BIORAD电泳仪及SDS-PAGE凝胶电泳操作规范.doc

使用BIO-RAD电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳的操作规范实验原理根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白，在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移速率主要取决于亚基分子量的大小。实验所用仪器FR-200A全自动紫外与可见分析装置 上海复日科技有限公司电泳仪 BIO-RAD公司TS-1型脱色摇床 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司实验用试剂低分子量蛋白Maker TAKARA4*上样缓冲 TAKARAPagn Blue protein staining solution Fermentas试剂的配制1. 贮液的配制（1） 凝胶储液取30g丙烯酰胺+0.8g甲叉双丙烯酰胺0.8g ,先用35ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至100ml，过滤。棕色瓶4保存一个月。（2）1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8)12.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解在80ml双蒸水中，用4mol/l盐酸调PH至8.8。再用双蒸水稀释至100ml，保存在4冰箱。（3）1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8)6.06g Tris溶解在40ml双蒸水中，用用4mol/l盐酸调PH至6.8。再用双蒸水稀释至50ml，保存在4冰箱。（4）10%过硫酸铵（APS）0.1g过硫酸铵+1ml双蒸水。使用前新鲜配制（5）Tris甘氨酸电泳缓冲液的配制（25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(pH8.3)）30.3gTris+ 144.2g甘氨酸+ 10gSDS，双蒸水定容至1L。 每次使用时10倍稀释。（6） 样品缓冲液使用4*SDS-PAGE loading buffer(Takara公司)，上样缓冲与样品比例1:3混匀，之后煮沸5min。 2. 凝胶的配制溶液成分分离胶12.5%10ml浓缩胶4%5mlH2O2.053.51凝胶储液4.150.8351.0mol/l Tris-Hcl(PH8.8)3.75-1.0mol/l Tris-Hcl(PH6.8)-0.62510%SDS溶液0.080.0610%过硫酸铵0.10.1TEMED0.010.006注：上表所标体积为配制两块胶的用量。若配制一块或多块，可按比例减半或加倍。具体步骤如下：1、样品制备：40 L蛋白+5*上样缓冲液10 L，煮沸5 min，冷却后放冰箱下层保存，备用2、制胶1） 用专用的医用棉口罩将胶板擦拭干净，电泳槽清洗干净，组装模具。注：必须使用专用的棉口罩擦拭胶板，且轻轻的向一个方向擦拭，以免划坏胶板。胶板和电泳槽未清洗干净，会影响电泳效果。2） 按上表成分配制分离胶，迅速摇匀，沿胶的一边，迅速灌入分离胶，注意勿打入气泡，迅速水封。3） 放置1.5h。4） 倾去蒸馏水，用滤纸将未倒干净的水吸干。5） 按上表成分配制浓缩胶，迅速摇匀，沿胶的一边，迅速灌入浓缩胶，注意勿打入气泡，迅速插入齿梳。6） 放置1h。注：新配置的凝胶，室温放置5h，使胶充分凝聚、混匀，之后再使用，效果更好。忌马上电泳。3、配制电泳缓冲及上样取配好的10*电泳缓冲130ml，用蒸馏水稀释至1300ml。将制好的凝胶用电泳夹固定至电泳槽中。注：短板朝里。若只跑一块胶，电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。倒入电泳缓冲液，液面至短板和长板之间。每孔上样量最大20ul。蛋白Maker上样量7ul。4、 电泳80V 45min;120V 45min。注：若120v 45min后，溴酚蓝指示剂前沿距离电泳板下端太远，可延长电泳时间，或适当增加电压，待跑至距电泳板下端1cm时停止电泳。5、 剥胶剥胶过程必须浸在蒸馏水中进行。6、 水洗电泳结束后，用蒸馏水洗胶三次，每次10min。7、 染色将胶至于脱色摇床上，使用考马斯亮蓝染色液（fermentas公司）过夜染色。注：考马斯亮蓝染色液的使用，请严格按照染色液说明上的操作步骤进行。考马斯亮蓝染液可重复利用3次，使用一次的染液请倒回使用一次的回收瓶中，使用过两次的染色液倒回使用两次的回收瓶中，用满三次才可废弃。8、 水洗蒸馏水洗1-2小时，洗去背景色。拍照。9、 清洗胶板和电泳槽。注：清洗和擦拭胶板时，请使用专用的医用棉口罩清洗，用水冲洗时，轻轻擦拭，将残留的胶清洗干净，注意不要太用力，以免划坏胶