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生物技术制药 第一章现代生物技术 一 现代生物技术的定义与主要内容 生物技术 BiotechnologyorBioengineering 对生物有机体 微生物至高等动 植物 或其组成部分 器官 组织 细胞或细胞器等 运用分子生物学 细胞生物学 生物化学 生物物理学 生物信息学等手段 研究 设计 改造 以改良生物乃至创造新的生物品种的一种技术体系 现代生物技术包括四个方面 1 基因工程 生物遗传物质 核酸的分离 提取 体外剪切 拼接重组以及扩增与表达等技术 2 细胞工程 细胞 也包括器官或组织 的离体培养 繁殖 再生 融合及细胞核 细胞质及染色体与细胞器 如线粒体 叶绿体等 的移植与改建等操作技术 3 酶工程 利用酶 借助固定化 生物反应器和生物传感器等新技术 新装置 高效优质地生产特定产品的技术 4 发酵工程 微生物工程 给微生物提供最适宜的发酵条件以生产特定产品的技术 生物技术的依据和出发点 生物有机体的种种机能 是生物在生长 发育与繁殖过程中进行物质合成 降解和转化的能力 即利用其新陈代谢的能力 反应器 代谢反应 酶 特定的遗传基因 核心基础 基因工程和细胞工程 工程菌株 或 工程细胞株 使酶工程或发酵工程生产出更多 更好的产品 发挥出更大的经济效益 酶工程和发酵工程现代生物技术产业化 特别是发展大规模生产的最关键环节 二 现代生物技术的优越性 一 不可取代性植物品种改良杂交育种基因工程改良品种 基因资源的来源可不受限制牛 猪 生长激素基因 鱼生长 发育快 体重速增人血红蛋白基因 猪体内生产人的血红蛋白 分离 可作为人血液的替代物 生长激素释放抑制因子 抑制生长激素不合时宜的分泌 肢端肥大症 的特效药 50万个羊脑 5mg样品 化学法 300多美元 5mg基因工程7 5升大肠杆菌发酵 5mg 成本几十美分 二 快速 精确试剂盒有效的早期诊断 遗传病 病毒引起的疾病和癌症等 McAb检查妇女妊娠比用抗血清法检查提高了灵敏度 怀孕后8天得知 准确率100 三 低耗 高效 酶 催化化学效应 无需高温 高压和强酸碱等 大大降低能耗的成本 能耗 例 L 苹果酸生产 生物技术 产氨短杆菌 收集菌体 固定化细胞 L 苹果酸原理 延胡索酸 L 苹果酸成本比化学合成降低几十倍 人生长激素 治疗侏儒病 一个患者每年需用量50个死人的垂体中提取基因工程生产价格为1 4提取 不需依赖死人脑 四 副产物少 不良反应小 安全性好疫苗的生产常规方法用血液 成本高 可带来病毒感染的危险性 现代生物技术用大肠杆菌如乙肝疫苗 凝血因子等 大大改进使用的安全性 2 生物导弹 McAb接抗癌药物 体内McAb只与该肿瘤细胞特异性结合 抗癌药物专一 靶向到肿瘤细胞小鼠的免疫球蛋白McAb免疫球蛋白分子中含有人免疫球蛋白分子片段 三 现代生物技术在医药领域的应用 在疾病诊断与治疗中的应用 1 单克隆抗体与疾病诊断妊娠试验FDA批准上市的McAb产品已有几十种 3 基因诊断核酸分子杂交技术80年代中期聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 体外扩增基因的方法产前和症状前基因诊断 苯丙酮尿症 珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良 甲型血友病 乙型血友病 成年型多囊肾 慢性进行性舞蹈病等遗传病 4 基因治疗因单一结构基因即编码蛋白质的基因缺陷所引起的遗传病 治疗 导入正常基因 校正缺陷基因引起的DNA代谢异常及细胞突变 使之恢复正常功能 二 未来医药卫生领域中的生物技术展望转基因动物生产的 转基因药物 1978年把人tPA基因转入小鼠受精卵发育成转基因小鼠并证明在其乳汁中能得到tPA美国DNx公司的 制药工厂 转基因猪环球基因药物公司转基因奶牛基因酶公司转基因山羊英国药物蛋白公司转基因绵羊 转基因药物 与基因工程药物相比 产量高 成本低 具有与人体自身产生的蛋白相同的生物学活性 乳腺细胞能进行一系列的翻译后修饰作用 包括糖基化作用等 正确地产生人体蛋白 2 人型McAb monoclonalantibody 的制备技术路线 鼠型McAb分子中更换一段人抗体分子中与抗原结合的链段 用蛋白质工程的方法 从人鼠杂交瘤细胞中直接克隆人抗体基因 并使之在细菌中得到表达 将人免疫球蛋白重链C区基因转入小鼠受精卵 发育成转基因小鼠 用特定抗原免疫 得人型化McAb 3 基因治疗 基因打靶 技术将外源基因定点整合到细胞基因组的某一确定位点上 因而能对缺陷基因进行原位修复 聚合酶链反应及其他不断涌现的分子生物学新技术将得到广泛应用 在细菌 酵母菌 昆虫细胞 哺乳动物细胞等不同的细胞内能得到高效表达的载体将不断地构建成功 大幅提高基因工程的生产效率 生物技术后处理工程和蛋白质工程将迅速发展 有目的地修饰 改造乃至重新组建 4 生物技术的各个环节 第一节生物药物 biopharmaceutics 一 概念利用生物体及其成分综合利用生物学 生物化学 微生物学 生物组织免疫学 物理化学 药学原理 方法加工制造的预防诊断疾病的制品治疗 第二章生物药物与生物技术药物概述 一 按来源和制造方法1 动物来源动物脏器资源丰富家畜 猪 马 牛 羊家禽 鸡 鸭海洋生物 海带 鲨鱼 海蛇 二 分类 2 微生物来源发酵法优点 1 微生物及其代谢物资源丰富 开发潜力大2 培养 繁殖快 产量高 成本低 便于大规模工业生产 不受原料 运输 保存 季节和资源供应影响3 生产的生物药物可综合利用代谢物和菌丝体 诱变选育良种 加入前体培养法4 体内酶的转化作用 使复杂 难反应能专一 迅速 4 化学合成氨基酸 多肽 核酸降解物及其衍生物 维生素 激素结构改造以高效 长效和高专一性 3 植物来源植物中的蛋白质 多糖 脂类 核酸等生物大分子的研究和利用 5 现代生物技术产品基因工程技术生产的重组活性多肽活性蛋白质类基因工程疫苗McAb多种细胞生长因子利用转基因动 植物生产的生物药物利用蛋白质工程技术改造天然蛋白质创造自然界没有的而功能上更优良的蛋白质类生物药物 生物技术药物 基因工程药物 BiotechDrugs 以DNA重组技术 包括基因工程技术 蛋白质工程技术 生产的蛋白质 多肽 酶 激素 疫苗 单克隆抗体和细胞生长因子类药物 细胞因子干扰素类 IFN IFN 和IFN IFN 有 lb 2a 2b等2 细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子类 IL 2和突变型白介素 2 TNF 和TNF受体 二 生物技术药物的主要类型 第二节生物技术药物 一 概念 3 造血系统生长因子类 粒细胞集落刺激因子 G CSF 巨噬细胞集落刺激因子 M CSF 巨噬细胞粒细胞集落刺激因子 GM CSF 红细胞生成素 EPO 促血小板生成素 TPO 干细胞生长因子 SCF 等 4 生长因子类 促进细胞生长 组织再生和创伤治疗 胰岛素样生长因子 ICF 表皮生长因子 ECF 血小板衍生生长因子 PDGF 转化生长因子 TGF 与TGF 神经生长因子 NGF 及各种神经营养因子 5 重组蛋白质与多肽类激素 人重组胰岛素 Humulin 人生长激素 rhGH 促卵泡激素 FSH 促黄体生成素 LH 绒毛膜促性腺激素 HCG 等 6 心血管病治疗剂与酶制剂 心血管疾病和抗肿瘤治疗 因子 水蛭素 组织纤溶酶原激活剂 tPA 尿激酶 链激酶 葡激酶 门冬酰胺酶 超氧化物歧化酶 SOD 葡萄糖脑苷酶及DNase等 7 重组疫苗与单抗制品 重组乙肝表面抗原疫苗 酵母 乙肝基因疫苗 重组乙肝表面抗原疫苗 CHO细胞 艾滋病疫苗和肿瘤疫苗等 己开发的McAb有72种 多用于治疗难治性疾病如预防移植物急性排斥 免疫性疾病和肿瘤等 8 基因药物 应用于基因治疗目的的DNA片段重组药物 基因治疗 将外源基因导入机体以达到治疗疾病目的 遗传性疾病 肿瘤 艾滋病 囊性纤维变性 糖尿病和心血管病等 我国已批准上市品 IFN 1b 自研 IFN 2a IFN 2b IFN IL 2 IL 2 125Ser G CSF GM CSF SK EPO EGF ECF衍生物 b ECF 胰岛素 GH TPO TNF衍生物 抗IL 8单抗乳膏剂 胸苷激酶基因工程细胞制剂 乙肝疫苗 痢疾疫苗等 细胞 生物有机体形态结构和生命活动的基本单位 第三章细胞工程技术概念 细胞工程 以细胞作为研究对象 运用细胞生物学 分子生物学等学科的原理与方法 按照人们的意志设计改造细胞的某些遗传性状 培育出新的生物改良品种或通过细胞培养获得自然界中难以获得的珍贵产品的新兴生物技术 细胞培养 细胞融合 细胞重组和遗传物质转移等 第一节细胞培养技术 细胞培养 生物体内某一块组织 用酶消化法分散成单个细胞 接种至特定的培养容器中并给予必要的生长条件 使其在体外生长繁殖的技术 细胞生长所需的培养条件 1 足够的营养 糖 氨基酸 维生素 无机盐等 2 生长环境 合适的温度 pH值 无菌条件 动物细胞的培养 先在无菌条件下用消化酶将组织分散成单个细胞 用培养基制成细胞悬液 使其在体外合适的条件下生长繁殖的技术 一 动物细胞培养 细胞培养的对象单个的细胞 组织培养的对象组织块 0 5 1mm 器官培养的对象器官的一部分或整个器官 动物细胞分类 动物细胞培养特征 贴壁依赖性细胞贴壁大多数动物细胞 非贴壁依赖性细胞悬浮血液淋巴细胞 肿瘤细胞 杂交瘤细胞 转化细胞系 兼性贴壁细胞附壁或悬浮 1 原代培养 or初次培养 primaryculture 胚胎或出生后几天幼龄动物的脏器获取组织 剪成小块长宽1mm 厚约0 5mm 胰酶消化分散 稀释成2 105 7 105 ml 分装到培养瓶 板 于37 CO2培养箱内培养 原代培养的细胞特点 离体时间短 一般具二倍体遗传性状 能较好地反映在体内的生长状况适合用作药物测试和细胞分化的研究工具 二 动物细胞培养技术 2 传代培养 或继代培养 subculture 将细胞悬液转接分装到 两个瓶中培养传代培养 分裂次数 正常细胞有限一般人正常细胞可传代50 60次 有限细胞系 finitecellline 传代过程中可无限制生长繁殖的细胞系 连续细胞系 continuouscellline 或已确立的细胞系肿瘤细胞 三 动物细胞培养的营养条件 1 培养基1 天然培养基成分复杂 来源有限血清 水解乳蛋白 胶原 胚胎浸液等 主含蛋白质 氨基酸 葡萄糖 激素 其他对维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学活性不可缺少的未知因子 促进细胞贴壁 中和有毒物质以保护细胞 动物血清 缺点 来源困难 成分不确定 使得细胞生长过程不易检测控制 水解乳蛋白乳白蛋白的水解产物 胶原动物真皮 豚鼠 牛 或大鼠尾腱来源的组织提取物胚胎浸液鸡胚和牛胚 特点 一定化学组成主要组分 氨基酸 维生素 糖 无机盐 其他一些辅助因子 2 合成培养基 根据天然培养基的成分 人工设计模拟合成 RPMI 1640 DMEM TC199 Eagle sMEM等 只能维持细胞的生存 基础培养基 须补充部分天然培养基 血清一般为10 20 维持细胞生长所需的激素和生长因子胰岛素 生长激素 表皮生长因子 成纤维细胞生长因子 细胞贴壁或铺展所需的细胞因子 纤维粘连素 铺展因子 胎球蛋白等 血清在培养液中的主要作用 提供 识别维生素 脂类 激素和金属的结合蛋白 调节被结合物的活力白蛋白与维生素 脂类 激素结合 将它们载入细胞转铁蛋白结合并传递铁离子 结合蛋白与有毒金属或热原结合则可解除它们的毒性 细胞生长所需的脂肪酸与微量元素磷脂质 胆固醇 前列腺素等 铜 锌等 蛋白酶抑制剂 使胰蛋白酶失活 保护细胞不受伤害 起缓冲作用 保证培养液pH的稳定 不足 成分复杂 含已知或未知成分 研究激素 细胞因子及药物的作用时 干扰分析 产品生产增加细胞培养后产物提取的难度 或影响产品的质量 大规模培养成本过高 消除因不同批次血清之间的差异而造成的实验误差 保证实验结果的准确性与稳定性 减少血清中可能存在的支原体 病毒所造成的污染 3 无血清培养基 优点与含有血清的培养基相比 产品的分离纯化更加容易 简化鉴定细胞工程产品的程序 来源稳定 供应充足 无血清培养基组成 基础培养基 替代血清作用的补充成分 1 激素和生长因子 激素胰岛素 胰高血糖素 生长激素等多肽激素及孕酮 氢化可的松 雌二醇等甾体类激素 胰岛素调节和控制细胞内多种代谢途径 加强糖原 蛋白质 甘油三酯及DNA的合成 生长因子表皮生长因子 神经生长因子 成纤维生长因子 血小板生长因子等 补充成分种类 2 结合蛋白 转铁蛋白增强细胞摄取和利用培养液中铁的能力 可结合有毒金属离子解除其毒性 白蛋白与脂类 金属离子 激素等结合后可以增强其作用 刺激细胞增殖 3 贴壁和铺展因子 常用的贴壁因子有纤维连结素 多聚赖氨酸 胶原 血清铺展因子则是一种糖蛋白 4 低分子量营养因子和元素 主要有维生素A 抗坏血酸 生育酚 硒等 四 动物细胞培养的环境条件培养基 培养环境无毒无菌 合适的温度 湿度 气体环境和pH值 1 培养环境无毒无菌 动物细胞体内强大免疫系统 清除和抵抗病原体 免受侵害体外培养失去抵御能力保证环境的无毒无菌 首要条件 加双抗液青霉素 链霉素以抑制可能存在的细菌和霉菌的生长 2 温度哺乳动物细胞35 37 动物细胞耐低温能力强于耐高温能力 41 细胞严重受损 4 细胞也能存活数日 培养物 保护剂 二甲亚砜 DMSO 或甘油 80 或液氮罐 温度可降至 196 可长期保存 3 渗透压 哺乳动物细胞260 320mOsm kg渗透压可略低培养过程中水分蒸发 渗透压 4 气体环境与pH 一般为95 的空气 5 CO2 O2参与三羧酸循环 产生能量供给细胞生长 CO2细胞生长所必需的成分 细胞的代谢产物 维持培养液的pH 大多数细胞生长的适宜pH是7 2 7 4 NaHCO3细胞培养过程中不断释放出CO2 使培养液变酸 添加一定量的NaHCO3 碳酸盐缓冲系统 维持培养液pH值相对稳定 五 动物细胞种质保存与运输超低温冰冻方法长期保存细胞冻存液中加入保护剂DMSO或甘油 将细胞密封保存于 80 或 196 的液氮罐中 1 保护剂甘油或DMSO 速渗透入胞内结合H2O 降低冰点 延缓冻结过程 同时增加胞膜对水的通透性 使H2O在冻结前缓慢透出胞外 减少胞内冰晶 降低因冰晶形成而造成的胞损伤 使用浓度甘油5 20 DMSO5 10 影响细胞冻存质量的因素 DMSO与甘油相比 作用更快 膜通透性更强 抗冻伤能力也更强 细胞在DMSO中30秒即可达到细胞内外平衡 甘油需2h 实验室普遍采用 2 细胞悬液的冻存速度 降低冻存速度使冰晶尽量在胞外形成 减少胞内冰晶的形成 降低对细胞的伤害 先缓降至一定温度 如 30 使胞外冻结 胞内脱水 再迅速降温 3 冻存后用液氮超低温保藏 150 196 细胞所有理化活动均降至最低限度 或忽略不计 长期储存 4 细胞复苏时的融化速度 细胞冻存管 取出迅速升温 胞外结晶在短时间内融化 避免因缓慢融化而使水分渗入胞内再次形成冰晶对细胞造成的伤害 操作 取出后立即投入到37 38 水浴 大规模培养 在人工条件下高密度大量培养特定的动物细胞从而生产珍贵医药产品的技术是实现大规模生产的关键技术 产品 疫苗 激素 细胞因子 单克隆抗体等 六 动物细胞的大规模培养 1 培养基与实验室培养基基本一致 除用无血清培养基外 无血清培养基中难生长细胞 采用渐适法驯化细胞 使适应于在无血清培养基中生长 无血清培养液中易出现细胞毒 与水中的微量元素或有机物污染有关 制备培养液须用高纯水 经0 22 m的微孔滤膜过滤除菌 培养方法 悬浮培养 贴壁培养 贴壁 悬浮培养 1 悬浮培养非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞气升式生物反应器或通气搅拌式反应器动物细胞胞膜薄 娇嫩易碎 抗剪切能力弱气升式反应器工作原理 通过气体的上下循环起到供氧以及搅拌的效果 培养规模5L 30L 100L到1000L 2 动物细胞大规模培养系统 而微生物可用搅拌式发酵罐 2 贴壁培养 单层细胞培养 贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞转瓶 滚瓶 培养培养瓶旋转使吸附在瓶壁上的细胞交替与培养液及空气接触而增加细胞吸附面积 优点 普遍适用于大多数细胞的培养 规模较易放大 容易实现罐流培养 及时放出陈旧培养液 补加新鲜培养液 缺点 操作较为繁琐 传代或放大时需要用蛋白酶将其从瓶壁上消化下来 3 微载体培养基本原理 将细胞附着在微载体的表面 后置于培养液中悬浮培养 使细胞在载体表面单层生长繁殖 商品微粒 DEAE 交联葡聚糖 二甲氨丙基聚丙烯酰胺 Biocarrier 及聚苯乙烯 Biosilon 等市售 优点 细胞附着表面积增大 细胞生长环境均一 条件易于控制 取样及细胞计数简单 细胞与培养液易于分离 大规模培养只需对微生物发酵罐或气升式深层培养系统稍加改进即可 适合于培养原代细胞 二倍体细胞株以及基因重组细胞 4 固定化包埋培养与微囊培养固定化包埋培养 大载体培养 用高分子材料将细胞包埋并制成固定化颗粒 在培养液中培养 海藻酸钙包埋 细胞溶液与海藻酸钠溶液混合 通过喷珠装置将其喷入氯化钙溶液 直径约2 6mm固定化颗粒 去除氯化钙溶液 通入培养液培养 海藻酸钠分子中含有重复排列的葡糖醛酸和甘露糖酸与钙离子作用后形成网络状凝胶珠 而将细胞包埋于其中 微囊培养 细胞包被在薄的半透性膜中采用海藻酸钠包埋细胞制成固定化凝胶颗粒 再用长链氨基酸聚合物 多聚赖氨酸包被形成坚韧 多孔可通透的外膜 液化胶化小珠 使其成胶的物质从多孔膜流出 活细胞或生物活性物质留在多孔外膜内 置气升式培养系统中进行增殖 5 中空纤维培养数千根中空纤维封存于特制的圆筒里 组成一个中空纤维培养系统 内室 灌流无血清培养液供细胞生长 外室 细胞贴附于管壁上 吸取从 内室 渗透出来的养分 迅速生长繁殖 单抗等细胞分泌的大分子量物质只能留在外室 且不断被浓缩 收集产物打开 外室 总出口 代谢废物为小分子物质 渗进内室 从其出口流出 不对外室细胞产生毒害 优点 培养器体积小 细胞密度高 产物浓度高 纯度高 自动化程度高 细胞生长周期长 缺点 价格较贵 5 中空纤维培养 第二节细胞融合 离体条件下用人工将两或多个不同种的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的过程融合后的细胞含两或多个不同的细胞核 异核体 随后细胞的有丝分裂中 有些不同胞核的染色体合并到一个核中 单核杂种细胞 而不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐步死亡 细胞融合 体细胞杂交 法国Barski1960年 过程 细胞在促融因子的作用下发生凝集现象 胞间质膜粘连 细胞融合 在培养过程中核融合 杂种细胞 1 细胞的准备贴壁培养的细胞 两亲本细胞混合培养悬浮细胞制成一定浓度的悬液 2 诱导融合需要添加促融剂诱导融合 一 动物细胞融合 小鼠和田鼠 小鼠和小鸡 小鼠和人远缘和超远缘的体细胞杂交 1 动物细胞融合的基本过程 3 杂种细胞的选择利用选择性培养基 使亲本细胞死亡而让杂种细胞存活 4 杂种细胞克隆选择与纯化杂种细胞 再经培养得所需要的无性繁殖系 2 促融剂 1 病毒 仙台病毒 灭活 两种不同动物细胞混合物中存在大剂量病毒 即细胞周围布满病毒 病毒或其组分在细胞间起粘连作用使细胞聚集成团 不同胞膜蛋白及膜脂质分子重新排布而结合成一个整体 诱导细胞融合的关键 使细胞膜蛋白重新分布 膜中脂质分子重排 2 PEG诱导 当不同种属动物细胞混合液中存在PEG时即产生细胞凝集作用 在稀释和除去PEG的过程中即产生融合现象 原理 脱水作用 细胞凝集 使膜结构变化 改变膜表面电荷或膜电位 膜蛋白颗粒聚集及脂层分子重排所致 特点 使用简便 结果稳定 诱导融合率较高等选用 分子量1000 4000 浓度30 50 3 电场脉冲 将两种细胞混合液经10 100V cm低强度非均匀交变电场作用 极化成偶极子而相互吸引紧密接触排列成串 此时对该状态的细胞施加瞬时高强度电脉冲 一般击穿电压为0 5 10kV cm 作用时间为30 50 s 细胞之间形成稳定的膜连接 可逆性电击穿 不同细胞间膜脂质分子重排而合并成一个双核或多核细胞 融合率高 可控性好 3 杂种细胞的筛选融合后细胞 五种 异型融合细胞 双核和多核 两种同型融合细胞 双核和多核 未发生融合的两种亲本细胞 1 筛选原理筛选目的 获遗传性状比亲本细胞更优良的杂种细胞 筛选原理 在培养过程中利用选择性培养基 杀死四种类型细胞 2 选择系统常用 HAT选择系统 抗药性选择系统及营养缺陷型选择系统 HAT选择系统 含一定数量次黄嘌呤 H 氨基蝶呤 A 胸腺嘧啶核苷 T 的选择性培养基 DNA为绝大多数生物的遗传物质 嘌呤核苷及嘧啶核苷是DNA的重要组成部分 是细胞生长的必需成分 补救合成途径 细胞从培养液或自身的代谢产物中吸收游离的嘌呤或嘧啶合成DNA 正常细胞中DNA合成途径 全合成途径 细胞利用简单的外源性小分子物质的从头合成途径 图细胞中DNA合成途径 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型 HPRT 细胞嘧啶全合成 补救合成嘌呤全合成胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 TK 细胞嘌呤全合成 补救合成嘧啶全合成 常用的亲本细胞 酶缺陷型细胞不能分裂的淋巴细胞 HPRT 及TK 细胞无嘌呤或嘧啶的补救合成途径 全合成需甲基 胞中由二氢叶酸还原酶作用而生 DNA合成的两条途径均受抑制 亲本细胞 HPRT 及TK 在培养过程中死亡 含氨基蝶呤的培养基 细胞融合物在HAT培养基上的选择结果图 同一药物对不同种类细胞的作用差异 一种亲本细胞对A药物敏感 而对B药物不敏感 另一种亲本细胞对B药物敏感 而对A药物不敏感 一定量A B于培养液中培养细胞 两种亲本细胞被杀死 融合细胞存活 抗药性选择系统 营养缺陷型筛选 有些细胞在一些营养物 如氨基酸 糖 嘌岭 嘧啶或维生素等 的合成能力上出现缺陷 难在缺少这种营养成分的培养基中存活 该营养的营养缺陷型细胞 亲本细胞色氨酸缺陷型 苏氨酸缺陷型 选择性培养基中不加入色氨酸和苏氨酸 只有融合所形成的杂种细胞才能生长 4 杂种细胞的表型杂种细胞 与亲本细胞相比 在遗传表型上变化 互补作用 两亲本细胞的某些生物学特性在杂种细胞中共同表达的现象 免疫淋巴细胞分泌抗体 体外培养不能生长 小鼠骨髓瘤细胞体外生长 杂种细胞既体外生长又分泌特定的抗体 激活作用 某一亲本细胞的不活动基因在杂种细胞中被激活的现象 HPRT 及HPRT 人的细胞分别与HPRT 小鼠细胞杂交 两种杂种细胞均显示出正常小鼠的HPRT酶活性 人的细胞具有激活小鼠细胞HPRT基因的作用 消失作用 亲本的某一或某些性状在杂种细胞中消失的现象 金黄色仓鼠黑色素瘤细胞很高的多巴氧化酶活性 可催化酪氨酸形成黑色素 但与不产生黑色素的小鼠成纤维细胞融合的杂种细胞不产生黑色素表明多巴氧化酶基因在杂种细胞中被抑制而呈隐性 激活与消失作用 杂种细胞中出现的同一亲本细胞的某一些非活动基因被激活 而另一些遗传性状同时消失的现象 小鼠胚胎发育早期的胸腺细胞能表达t12抗原 但成年后不表达t12抗原而表达H 2抗原 说明其带有t12和H 2两种抗原的基因 但在不同的发育阶段不同的基因之间表达存在差异 当成年小鼠的胸腺细胞与小鼠胚胎性癌细胞融合所形成的杂种细胞中 H 2抗原基因呈隐性 而t12抗原基因呈显性 两种亲本细胞的遗传物质融合在一个细胞中后 某些遗传物质经过一段时间后可能会逐渐消失 其结果是由该基因所控制的性状也就随之消失 遗传物质虽然存在 但在杂种细胞中可以表现出其基因性状 显性 也可能不表现出其基因性状 隐性 细胞重组 在体外条件下运用一定的实验技术从活细胞中分离出各种细胞的结构或组成 部件 再把它们在不同的细胞之间重新进行装配 而得到新的生物活性细胞 第三节细胞重组 celleconstruction 一 核移植技术 nucleartransplantation 借助显微操作仪 利用微吸管将一个细胞的细胞核吸出并移植到另一个去核的细胞中 最初鱼类和两栖类动物后扩展到高等哺乳动物小鼠和家养动物等 二 细胞器移植细胞器种类很多 分离与纯化也较容易 不过研究较多的是叶绿体和线粒体的移植 一 叶绿体移植 叶绿体进行光合作用 把太阳能转变为化学能 高光合效率作物的叶绿体转移到低光合效率作物中 增产 叶绿体移植的方法 将分离纯化的叶绿体与原生质体一道培养 通过细胞的胞饮作用将叶绿体摄入原生质体 经过培养 原生质体再发育成完整的植株 二 线粒体移植 线粒体有自己的遗传基因 能够合成一些蛋白质 线粒体的移植 可传递遗传信息 改变受体细胞的某些特征 如抗药性和雄性不育性等 移植方法 微注射 载体转移 胞饮摄入等 第四节单克隆抗体技术 外源性物质侵入人体或动物体时 免疫反应 即 B淋巴细胞激活 增殖 分化成浆细胞 抗体 体液免疫 血清 体液 外分泌液 获得一定特异性抗体的经典方法 用抗原免疫动物 如兔 马 羊 鼠等 从其血清中进行分离 多个抗原表位 决定簇 针对多种抗原表位的混合抗体 多克隆抗体 缺陷 1 抗体不均一 特异性差 效价低 用于检测会影响检测的精确性和灵敏度 2 成熟的能分泌抗体的淋巴细胞寿命很短 一般只有几天 抗体的产量有限 无法实现大规模生产 骨髓瘤 恶性肿瘤 细胞体外培养 无限制繁殖 但不能产生抗体 遗传表现型HPRT TK HPRT TK 及HPRT TK 免疫淋