银杏叶中黄酮类化合物的含量测定.doc

江苏畜牧兽医职业技术学院毕业论文（设计）专业药品质量检测技术班级 药检071 学号200703123124论文 (设计) 题目：银杏叶中黄酮类化合物的含量测定 学 生 姓 名： 刘江南 设 计 地 点：江苏畜牧业兽医职业技术学院 指 导 教 师： 赵丽 职 称 讲师 论 文 完 成 时间： 2010年5月20日 银杏叶中黄酮类化合物的含量测定刘江南药品质量检测技术摘 要：黄酮类化合物是银杏叶的主要药用成分，其黄酮含量在很大程度上决定着银杏叶的利用价值。以十二烷基硫酸钠(SDS)一正丁醇一正庚烷一水微乳系统为流动相，预制聚酰胺薄层板为固定相，通过调节微乳系统的极性，较好地分离出十几种银杏叶黄酮。与传统的流动相系统有机溶液系统相比，微乳系统显示出较强的分离优势。通过对大龄银杏叶不同生长时期黄酮含量的测定与比较，分析银杏叶中黄酮含量随生长期的变化规律，揭示出大龄银杏树采摘叶片的最佳时期。试验结果表明：不同生长时期的银杏叶黄酮含量变化幅度较大,在1年中黄酮含量出现2次峰值，8月份出现第1个峰值，黄酮含量为0.884%, 以后下降较快,10月叶色发黄后又上升到最高值 0.977%。关键词：银杏叶 黄酮含量 薄层色谱 生长时期 高效液相色谱Title：In Gingko leaf flavonoid content determination LiujiangnanDrug quality testing technologyAbstract：Flavonoids are the main medicinal components of ginkgo biloba,its flavonoid content to a large extent determines the value of ginkgo biloba use. Sodium dodecyl sulfate (SDS) 1-butanol 1-heptane microemulsion system of water as the mobile phase, pre-polyamide thin-layer plate as the stationary phase, by adjusting the polarity of the microemulsion system, well separated a dozen of flavonoids. Mobile phase with the traditional system - the organic solution systems, the microemulsion system showed strong separation advantage.Leaves of Ginkgo biloba on older growth and flavonoids content during the comparison, analysis of flavonoids of Ginkgo biloba in the variation with growth phase, revealing the older leaves of ginkgo trees picking the best time. The results showed that: different growth stages of the content of flavonoids in a significant reduction in 1 year in the flavonoid content of 2 times the 1peak, in August the first one peak appears, flavonoid content of 0.8844%, then decreased rapidly in October leaves yellow color after rising to a maximum value 0.977%.Key Words：Ginkgo biloba,Flavonoids content,TLC,Growth period,HPLC.21 前言11 银杏叶的介绍银杏(Ginkgo bilobal，又名公孙树，白果)系裸子植物门银杏科植物，有“活化石”之称，是当今地球上最古老的树种之一，为我国特产，我国银杏资源拥有量占世界总量的75左右，占世界首位1,2。银杏是中国特有而丰富的经济植物资源，是一种历史悠久的植物，除具有很高的观赏价值外，银杏的果实和叶片也有很高的药用价值。银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，又名白果叶。在我国古代已作为药用，其能“益心敛肺，化湿止泻，治胸闷心痛，心悸怔忡，痰喘咳嗽，泻利白带。3”银杏叶的研究始于本世纪60年代，由于发现其具有抑制血小板活化因子的作用，能够改善心血管系统的渗透性、弹性及血液流变速度，对机体组织具有抗缺氧的能力，故引起国内外医药界的关注。利用银杏果叶的有效化学成分和特殊医药保健作用加工生产保健食品，药物和化妆品，正引起国内外研究、开发、生产单位的重视，各国众多企业竞相研制生产以银杏为原料的天然绿色产品，替代对人体健康有较大副作用的合成化学品，从而为中国的银杏资源的开发利用开辟了无比广阔的前景，迅速提高了银杏的利用价值及其对经济、社会和生态的影响，为社会创造了就业和财富，为人类带来了健康和长寿。12 银杏叶的作用银杏叶能够抗衰老，消除人体自由基，改善血流量，增加脑供血。目前，银杏叶研究主要集中在多糖4,5、萜类内酯6、黄酮类化合物7,8，银杏叶挥发油的提取及分析比较少。彭洪9采用水蒸气蒸馏及GCMS分析鉴定出银杏挥发油17种化学成分；周维书10按中国药典法提取了挥发油并分析出35种化学成分。1.2.1 改善血液循环临床研究发现，银杏提取物能使血液粘稠度降低，并调节血脂，抑制血小板聚集，增加红细胞的变形能力，减少或抑制微血栓的形成，并增加心脑的供血。 通俗的解释，银杏能保护动脉、静脉和毛细血管免受伤害，并增强强度和弹性。加之，银杏能通过降低血小板（一个形成动脉硬化的关键因素）粘度、保护红细胞免受伤害并保持其分布均匀，因而可以起到促进血液循环的作用，并能达到治3疗缺血性心脑疾病的目的。1.2.2 防治脑梗死目前，以脑梗死为代表的脑缺血性疾病已上升为人类第三大致死原因，成为倍受瞩目的常见多发病。发病患者急性期过后常留下许多后遗症，如行为功能障碍，认知障碍等，给患者及其家庭都造成很大的痛苦。对于此类疾病，目前最重要的防治手段是提倡使用神经保护剂。在神经保护剂的筛选中，许多科学家把目标定位于对中药的开发和研究上。其中，对银杏叶提取物，在临床也取得了肯定疗效。 研究证实，银杏叶片提取物中的黄酮类物质可明显增加脑的血流量，提高脑组织耐缺氧能力；银杏内酯类物质中的内酯A、B，尤其是苦内酯B可以保护脑组织免受损伤；内酯类物质中的白果内脂可以保护神经细胞免受缺血性损伤。因此，银杏叶提取物具有调节血脂，抑制血小板聚集，扩张脑血管，清除自由基，降低脂质过氧化反应等，保护脑组织免受缺血缺氧的损害。临床可用于治疗脑缺血、脑梗死、脑外伤后遗症、老年性脑功能障碍等。1.2.3 防治冠心病及心肌梗死冠心病是由于心肌的严重缺血而引起心肌的损伤和坏死，而急性心肌梗死是其临床的主要表现。急性心肌梗死在欧美国家已成为严重的健康问题，美国每年大约有150万人发生，其中大约有13的人死亡。在我国急性心肌梗死同样也是一个引起关注健康问题，流行病学调查结果显示，心肌梗死患病率在我国平均为1100000，死亡率为患病率的10。研究发现，银杏提取物具有扩张冠状动脉，增加缺血心肌的血流量，降低心肌耗氧量，改善心肌缺血的症状等作用，不仅对冠心病、心绞痛有确切疗效，也能减低该疾病的发生率。1.2.4 预防血凝块形成血小板黏在一起，能使血凝块的形成，而血凝块会导致心脏病发作或中风，如果通往心脏的动脉里有血凝块，就会造成心脏病发作；如果血凝块停留在通往脑部的动脉里，就会造成中风。黄酮类化合物对于抑制血小板凝集也有显著作用：黄酮类化合物对凝血因子具有较强的抑制作用，故表现出较好的抗凝血作用。黄酮类化合物还可降低血管4内皮细胞羟脯酸代谢，使内壁的胶原或胶原纤维含量相对减少，利于防止血小板粘附凝集和血栓形成，有利于防治动脉粥样硬化11。实验表明，不同浓度的黄酮类化合物对抑制血小板凝集有不同程度的作用12。另外还可以使处于异常状态下的血管功能恢复正常水平13。1.2.5 具有抑制动脉平滑肌细胞增殖作用血管平滑肌细胞(VSMC)迁移和过度增殖是高血压、动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄等血管增生性疾病的基本特征。邻近受损的内皮细胞和进入内皮下层的吞噬细胞释放大量细胞因子和生长因子，这些生物活性物质可促进中层的VSMC向内膜下迁移并过度增殖，同时分泌很多活性物质及细胞外基质成分，导致血管重构，一旦VSMC的增殖超过盘管的代偿能力，会导致血管壁增厚和血管腔变窄，最终引发急性心、脑血管病。银杏内酯能抑制动脉壁平滑肌细胞增殖。魏恩会等观察银杏内酯B对主动脉平滑肌细胞增殖的影响，结果发现无论是否用血管紧张素II诱导，GB与银杏内酯A和B的混合物均呈浓度依赖性地抑制SMC(主动脉平滑肌)的增殖，其机制与阻止细胞有丝分裂期有关，说明GB可抑制动脉壁SMC的增殖，该作用不完全取决于血小板活化因子受体的拮抗活性。总的来说，银杏叶片制品临床用于治疗冠心病、心绞痛、脑梗死等疾病已收到满意效果。但实际上，它对疾病的治疗作用还远不止于此。银杏叶片还能防治6种疾病，比如：防治糖尿病引起的视网膜病变；治疗哮喘；抗肿瘤14；缓解急性肺损伤及抗衰老活性；对痔、静脉曲张的治疗作用；防治老年性痴呆症。13 银杏叶的化学成分黄酮类化合物是银杏叶的主要药用成分，其黄酮含量在很大程度上决定着银杏叶的利用价值。银杏叶中黄酮类化合物含量较高，用紫外分光光度法测得我国泰兴银杏叶中所含黄酮类物质占5.91%15。其中单黄酮类主要为山奈酚(Kaempferol)和槲皮素(Quercetin)的单、双和三糖甙化合物，糖元多为葡萄糖和鼠李糖；其他尚有异鼠李素(Isorhamnetin)、杨梅黄素及芸香甙等。双黄酮类有穗花杉双黄酮 (Amentoflavone)、白果素(Bilobetin)、银杏双黄酮(Ginkgetin)、异银杏双黄酮及金松双黄酮等。此外尚有儿茶素类化合物4种。银杏叶含有的二萜内酯和倍半萜内酯均为其特有成分。现分离出的二萜内酯有银杏苦内酯A,B,C,M等4种，其中银杏苦内酯B(BN520210)的抗PAF活性最强；倍5半萜内酯为白果内酯(Bilobalide)。14 银杏叶的剂型研究我国银杏叶制剂的开发起步较晚，90年代起方呈蓬勃状态。1990年上海天工植物制品厂出品的银杏叶干浸膏已销往欧洲；1990年西安国药厂与沈阳药学院共同研制的出口用银杏叶标准提取物，其质量与法国Hawaiian Agronomics SA公司的标准相一致；1991年湖南医工所与宁远县天然植物提炼厂合作研制，总黄酮含量按出口标准分别为16%及24% 2种规格，收率为2%3%，已初步形成生产规模；上海药物所与康恩贝制药公司用银杏叶开发的制剂天保宁已上市，临床用作冠脉循环改善剂；国家“七五”中医药攻关项目银杏口服液于1992年在遵化制药厂投产。国外银杏叶提取物(Egb)剂型较丰富，有片剂、滴剂、薄膜片剂、胶囊、注射液、外用剂、酊剂、液体喷雾剂、洗剂、软膏、霜剂、气雾剂和口服液等16。银杏叶的各种提取物、各种制剂以及营养品等都要有明确的质量标准，只有严格的标准化，才能控制产品的内在质量。目前国际上公认的质控标准是：银杏黄酮甙含量为20%30%，银杏苦内酯A，B和J的含量为2.5%4.6%，白果内酯为2%4%，烷基酚含量小于110-6，单宁类物质原花色素含量小于10%。丁青龙等17曾对国内不同厂家的制剂进行质量测定，黄酮含量基本合格，但内酯含量不足，故国内银杏叶制剂的质量有待提高。15 我国银杏叶制剂的发展前景虽然我国在银杏叶制剂开发中还有很大空缺，但这主要是因为国际上还没有统一的质量控制标准，不少厂家虽已生产出高质量的Egb，但由于竞争原因不肯公布其质量标准；另外国内提取银杏叶中有效成分的技术低、生产条件差、研究进展缓慢，也影响了银杏叶制剂的质量。鉴于这种情况应进一步加强对银杏叶制剂的研发工作，充分利用我国得天独厚的银杏树资源，采用先进、可靠、规范的检测方法，对我国各地银杏叶资源的品位加以评定，以期合理使用；大力开展其工艺研究，为提高产品质量不懈地进行工艺改进，使剂型多样化，争取出口；为开拓国内市场，应加大临床研究的进度，为推广应用创造条件；要开拓银杏叶提取物的用途，例如饮料、清凉口服液、复方制剂和化妆品等，其提取物十分稳定，不需要加乙醇或表面活性剂。相信随着现代科学技术的发展，银杏叶会被人们充分开发利用，从而造福人类。62 实验部分21 银杏叶中黄酮类化合物的含量测定2.1.1 仪器与材料2.1.1.1 仪器与药品薄层色谱紫外分析仪(天津市琛航科技仪器有限公司)、自动点样仪(天津市琛航科技仪器有限公司)、定量毛细管(天津市琛航科技仪器有限公司)、双槽展开缸(重庆玻璃仪器厂)、电吹风、聚酰胺预制板(台州四青生化材料厂)、新型喷雾瓶(华西医科大学仪器厂)，十二烷基硫酸钠(SDS)、正丁醇、正庚烷、三氯化铝、乙醇均为分析纯。对照品：芦丁、槲皮素、GBE样品(均为中国药品生物制品检定所出品)。2.1.1.2 实验材料银杏叶，2009年购于甘肃南邻地区。2.1.2 实验方法2.1.2.1 展开剂系统的筛选2.1.2.1.1传统展开剂系统传统展开剂系统一般为油液系统，极性较小。本实验用甲苯、醋酸乙酯和吡啶以不同比例作为展开剂，都仅能展开两三个点。不能较好分离银杏黄酮。2.1.2.1.2微乳液系统的配制按照十二烷基硫酸钠(SDS)：正丁醇：正庚烷=13.777：15.6：2.7(重量比)称取各试剂，加少量水制成微乳液。再依据微乳液的比例，加适量水，静置24h备用。2.1.2.2 配置供试品GBE液取不同批次的银杏叶，剪碎后用甲醇提取，收集甲醇提取液、干燥后为棕黄色粉末。分别称取各批粉末适量配制甲醇溶液。2.1.2.3 配置对照标液称取芦丁，槲皮素标准样品配制成1mg/mL甲醇溶液，作为对照标准溶液。72.1.2.4 配置指纹图谱对照液称取中国药品生物制品检定所提供的银杏叶黄酮样品配制成2 mg/mL甲醇溶液，作为对照品。2.1.2.5 高效薄层色谱方法用定量毛细管吸取对照品溶液、对照标液、GBE样品液于聚酰胺膜上点样，直径约1mm，吹干。以不同含水量的微乳液为展开剂，于已饱和的双槽展开缸中展开10cm，取出烘干。均匀喷洒1氯化铝乙醇溶液，烘干，于365nm紫外灯下观察。3.1.1 指纹图谱结果3.1.1.1 影响展开效果的因素3.1.1.1.1展开剂含水量对展开效果的影响不同含水量的微乳液对银杏黄酮A和B某一成分移动影响(如图1-1)A.实验室GBE样品；B. 中国药品生物制品检定所GBE样品图1-1 银杏黄酮Rf值与微乳液含水量的关系从图1-1可以看出银杏黄酮的Rf值随着微乳液含水量增加而下降。实验室样品GBE在微乳液含水量较高时的砒值比对照品中国药品生物制品检定所高。8随着微乳液含水量的降低，两者的Rf值相差不大，当含水量为6575时，两者Rf值相同。微乳液含水量与斑点形态的关系如表1-1所示。表1-1 微乳液含水量与斑点形态的关系微乳液含水量/% 半点个数清晰度Rf展开时间/h2023模糊小1.04034模糊小2.0608拖尾严重小3.56712清晰较大4.57012少量拖尾小6.0808拖尾严重小15.0可以看出，在微乳液含水量67左右时，Rf值约为0.6，其余成分的斑点较均匀清晰的分布上下，颜色亮黄，无拖尾，斑点间隔较大。在含水量为70时，虽然斑点较多，但有少量拖尾，不能有效分离。综合考虑，宜选择含水量67微乳液作为银杏黄酮分离的展开剂。3.1.1.1.2酸度对展开效果的影响由于黄酮中酚羟基的存在，使其略显酸性。中性展开剂对其附着能力差，斑点均有拖尾。而强酸易造成黄酮苷类分解，因此选择弱酸：甲酸调节酸度。实验证明，选择含展开剂体积8的甲酸对银杏黄酮展开效果最好。3.1.1.1.3饱和度对展开效果的影响展开剂置入展开缸中，实验必须封闭饱和。未经饱和就展开的薄层板上，展开剂上行速度不一致，导致上线呈曲线，使实验无效，选择饱和时间为25min为宜。此外，展开板的种类、湿度、温度等均对银杏黄酮的分离有影响。硅胶类展开板对银杏黄酮吸附能力差，只能分离23个斑点；选择聚酰胺薄层板分离效果最好；展开通风橱内湿度以相对湿度为68为最好；温度为室温。93.1.1.2 薄层色谱指纹图谱结果银杏叶黄酮的分离，以含水量67的微乳体系-甲酸(92：8)为展开剂，聚酰胺薄层板为固定相。分离结果如图2所示。由色谱指纹图谱可见，银杏黄酮能被此微乳系统完全分离。样品3即中国药品生物制品检定所提供的银杏黄酮和其它样品一样，分离出12个点。从色谱图可见，银杏叶中均含有芦丁和槲皮素，虽然两者的极性相差不大(黄酮苷的结构类似)，但芦丁的分子量比槲皮素大，因此芦丁的Rf(0.528)比槲皮素的Rf(0.642)较小。各批次银杏叶的黄酮成分相差不大。紫外灯下各批次的黄酮斑点颜色为亮黄色。但由于随着季节和采摘时间的不同，银杏叶黄酮的成分有差别18，所以斑点颜色有深浅。据此也可作为制订GBE的质量标准的依据。1.槲皮素对照品；2芦丁对照品；3中国药品生物制品检定所提供GBE样品；4GBE样品A；5GBE样品B； 6GBE样品C；7GBE样品D图1-2 各批银杏叶薄层色谱指纹图谱3.1.1.3 银杏黄酮分子结构对Rf的影响样品的极性越大，则被吸附剂吸附得越牢固，在相同条件下，迁移速率就越10小，在色谱图上的Rf值就越小。色谱图的下部，是黄酮极性大的成分，如黄酮的盐酸盐等。中部为槲皮素和芦丁，槲皮素是芦丁的一种分解产物。推测有可能是在提取或分析过程中，使芦丁有所分解。上部是比槲皮素极性更小的黄酮，如二氢黄酮及其化合物等。可以剪开斑点，溶于甲醇过滤后在HPLC上精确分析。4.1.1 讨论由十二烷基硫酸钠正庚烷正丁醇以13.77：15.6：2.7的比例溶于67的水中组成的微乳体系，适合于分离银杏叶黄酮。该微乳液加入8体积的水，可以有效防止黄酮斑点的拖尾。梁淑芳等用微乳体系分离沙棘黄酮得8个斑点19，马柏林等也用此方法分离杜仲黄酮得9个斑点20。在其他人的微乳液基础上，结合黄酮的结构特点，调节微乳系统的极性，温度和湿度，分离出银杏叶提取物黄酮斑点12个。改善了GBE的薄层色谱分离技术，为平面色谱在中药鉴定和色谱分析中的应用展示了良好的前景。薄层色谱法在中药分析中有以下特点：对被分离物质的性质没有限制，使用范围广；固定相使用一次，样品预处理较简单；薄层具有多路柱效应，可同时进行每个样品的分离，所以样品的分析时间短；不受一种监测器的限制，在同一色谱柱上可根据被分离化合物的性质选择多种检测方法进行定性或定量，并且可以重复测定；当吸附剂高效化、定量分析仪器化、自动化后，提高了薄层色谱的分辨率及重现性。因此气相色谱法和高效色谱法不能代替薄层色谱法。用薄层色谱指纹图谱方法分析了几批银杏叶提取物，符合中药指纹图谱对薄层色谱技术的要求，且操作简单、设备易得，非常适合我国的国情。为银杏叶药材的标准化种植，银杏叶提取物及其制剂的质量控制提供了简便、经济可靠的方法3 对银杏叶发展的展望当今国内外对于银杏叶的化学成分的研究很多，各国科学家已经从银杏叶中分离鉴定出很多成分，并从中发现了重要的活性成分。面对银杏叶中不断涌现的新的化学成分，有必要对其结构进行归纳、总结。银杏叶及其提取物用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病，其中银杏叶黄酮、萜内酯和聚异戊烯醇是主要的药效成分，具有显著的疗效，且无明显副作用。目前，国内关于银杏叶化学成分的11研究，只是针对总黄酮、银杏内酯(A，B)、白果内酯，而对其他化合物的研究较少，这主要是提取分离获得的物质数量有限，制约了进一步对活性的研究。如果能在活性方面作深入的研究，开展构效关系的分析，可以更有效地促进银杏叶的开发和利用。12参 考 文 献1. 梁立兴.加入WTO对中国银杏产业的影响和对策.林业科技通讯，2001，(2)：29312. 苏瑞强，周宗仪，辛建玲.高新技术在银杏叶有效成分提取中的应用研究.时珍国医国药，1998(6)：5495503. 江苏新医学院.中药大辞典(上).上海：上海科学技术出版社，1986：14364. 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