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不同温度对细胞骨架的影响 【摘要】：细胞骨架是维持细胞生命活动非常重要的结构成分,狭义上主要是指细胞质骨架,其装配和解聚受酸碱度、温度和钙离子浓度等多种因素的影响。本文使用显示细胞骨架最常用的考马斯亮蓝染色法初步探讨了酸碱度和温度对细胞骨架的影响程度。试验结果表明,不适当的酸碱度和温度都会导致细胞骨架的解聚,光镜下呈现不同程度的云雾状和空泡状,云雾状多出现在酸碱处理组,而空泡状多出现在温度处理组。【作者单位】： 龙岩学院生命科学学院;10生物技术 【关键词】： 细胞骨架 考马斯亮蓝 酸碱度 温度 目的 原理，材料，方法，预测结果，参考文献，设计依据一、实验目的通过本实验的学习，了解在体外，温度对细胞骨架系统装配的影响，训练学生如何设计实验步骤来验证书本的知识点，使知识点掌握得更牢固，从而培养学生动手操作能力，独立思考问题，并通过查阅资料解决问题的能力，为今后遗传学的学习、毕业论文的完成等奠定基础。 二、实验原理细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管、中间纤维。一些细胞骨架系统的装配和去装配在时间和空间上是高度有序的，在体外，它们在温度因素的作用下，可进行装配或去装配过程。考马斯亮蓝法显示细胞骨架的原理1、蛋白质的细胞化学：（1）蛋白质是细胞中重要的结构和功能成分，某些染料能与蛋白质的氨基酸残基结合，产生颜色反应，借以对蛋白质进行显示。这种对蛋白质直接染色的细胞化学方法并不多，特异性也不强。（2）目前，应用最广泛的方法是利用免疫标记技术对蛋白质进行特异性显示，通过荧光标记细胞骨架成分的单克隆抗体对细胞骨架蛋白进行显示。2、细胞中的细胞骨架成分：（1）、细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构。其概念具有狭义和广义之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同包括微丝、微管和中间纤维；广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。（2）、细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。温度对细胞骨架影响的原理;温度处理导致解聚的骨架蛋白分布于胞质边缘，解聚后微丝蛋白重排，胞质内出现大面积，大小不一的空泡。经过一段时间不同温度的处理，细胞核有变小的趋势，从何细胞骨架也有影响。三：主要仪器、试剂实验用品(1) 材料 洋葱内表皮(2) 器材 显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH 计。普通冰箱、低温冰箱、培养箱，恒温水浴锅。四个培养皿，刀片，镊子(3) 试剂1. 0.01mol/L 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3） 50ml0.15mol/L NaCl双蒸馏水加至1000ml2. PB0.2mol/L Na2HPO4 77ml0.2mol/L NaH2PO4 23ml3. M-缓冲液咪唑(PH 6.7) 50mmol/LKCl 50mmol/LMgC12 0.5mmol/LEGTA 1mmol/LEDTA 0.1mmol/L巯基乙醇 1mmol/L甘油 4mmol/L用1mol/L HCl 调pH 至7.2。4. 1%的Triton X-100/M-缓冲液5. 0.2%考马斯亮蓝R250 染液甲醇 46.5ml冰醋酸 7ml蒸馏水 46.5ml6. 3%戊二醛- PB 溶液（PH7.3）四：实验方案步骤一：温度处理方法撕取洋葱鳞茎上的鳞叶,置于4 个培养皿中,分别在- 18 冰箱、4 冰箱、50 培养箱和20 (对照) 中处理1h。步骤二：细胞骨架的制片与观察首先将洋葱片放入装有pH 值6.8 磷酸缓冲液的小玻璃瓶中，使其下沉；然后吸去磷酸缓冲液，用1%Triton X- 100 处理25min（抽提骨架以外的蛋白质）；吸去Triton X- 100 后，用M- 缓冲液洗3 次，每次3min，洗涤的同时可以稳定细胞骨架；再用3%戊二醛固定15min；吸去戊二醛后，用PBS 洗3 次，每次3min；用0.2%考马斯亮蓝R250 染色15min；用蒸馏水洗涤2 次；取出洋葱鳞茎内表皮，展平在载玻片上，空气干燥；最后镜检。（1）、洋葱表皮细胞取材后，用PBS液轻轻漂洗。（3次， 3min/次）（2）、用1%TritonX-100/M缓冲液处理15min （30min），室温或者37均可。（3）、M缓冲液轻轻洗细胞3次（3-5min/次），M缓冲液有稳定细胞骨架的作用。（4）、3%戊二醛-PBS液固定细胞5-15min（不制备永久装片，甲醇-冰醋酸混合液。固定15-20min）。（5）、PBS液洗涤细胞若干次（3次，3-5min/次），用滤纸吸干。（6）、0.2%考马斯亮蓝R250染色30min，小心用水漂洗，空气干燥，封片，观察。（蒸馏水洗2次，滴加二甲苯透明，制成水装片）（7）、用普通光学显微镜观察，可见到深蓝色的纤维束，粗细不等，基本上平行排布，张力纤维是一种动态结构，在充分贴壁铺展的细胞中纤维挺直、丰富，形态比较典型，当将贴壁培养的细胞从基质表面除下时，细胞变圆，张力纤维随之消失。取洋葱内皮1cm 左右置于含PBS 液的载玻片上湿润后，吸去PBS加2 滴1%Triton X-100/M-缓冲液，15-30 min吸去缓冲液，M缓冲液轻轻洗细胞3次，加3%戊二醛-PB 溶液，固定30min？加PBS 洗2 次，共3min加0.2%考马斯亮蓝R250 染色30min用PBS 洗2 次，共2min，吸干镜检并绘图图4-4 细胞骨架标本制作过程五：依据：在真核细胞的细胞质中分布着一种纤维状的结构系统，即细胞骨架，它包括微管、微丝和中间纤维三种不同类型的纤维结构。这些骨架纤维是由不同的蛋白质亚单位以特定的方式聚合形成的。正是因为这种独特的蛋白质组成和结构特点，使得细胞骨架具有其特有的理化性质，一些能使蛋白质变性的化学试剂（如秋水仙素、SDS）还有物理因素都可以使其或多或少地发生变化。六、实验操作注意事项：（1）、每一次加液或染色后，应用PBS 洗2 次，并用滤纸吸干。PBS冲洗应适度，否则洋葱表皮细胞吸收大量水分易使液泡过分涨大，影响实验结果的观察。（2）、实验操作中，Triton的抽提是最关键的步骤，应注意抽提适度,建议应控制在30min 左右。七：实验结果：实验心得整个实验做下来，感觉与其他那些照着实验讲义做的实验有很大不同，而这样的实验一做确实发现我们在实验上的不足。进大学2年以来做实验都养成了照着讲义按部就班的习惯，写起实验报告也有了自己一套惯用的格式，感觉实验不过如此。而探究性实验的实验拿到手，面对空无一字的讲义顿时傻了眼，一下子不知道从哪里入手，也不知道该做什么实验。所以觉得自己真的对一些生物