双水相萃取详细资料(ppt 44页).ppt

方盼赵梅 双水相萃取 一 两水相的形成 二 相图 三 分配理论 四 影响分配的参数 五 应用 目录 常用的溶液萃取法能用来提取生物大分子如蛋白质吗 Question Reason so 大部分萃取采用一个是水相 另一个是有机相蛋白质遇到有机溶剂 易变形失活有些蛋白质有极强地亲水性 不能溶于有机溶剂 通常的溶剂萃取法应用于提取生物大分子是有困难的 但双水相萃取法含水量高 接近生理的环境中进行萃取 不会引起生物活性物质失活或变性 双水相体系简介 1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂和可溶性淀粉的水溶液混合时先得到一个混不透明的溶液 随之分为两相 上相富含明胶 下相富含琼脂 或淀粉 这种现象被称之为聚合物的不相溶性 从而产生了双水相体系 双水相系统 是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统 葡聚糖 Dextran 与聚乙二醇 PEG 按一定比例与水混合 溶液混浊 静置平衡后 分成互不相溶的两相 上相富含PEG 下相富含葡聚糖 见下图 一 两水相的形成 两种亲水性聚合物混合1混合熵的增加 自发进行 分子的数目2分子间作用力 分子间各基团相互作用之和 分子的大小对大分子而言 由于相对分子质量较大 分子间作用力与熵增加相比占主导地位 原理 作用力为斥力 形成两个水相 两种高聚物分别富集于上 下两相 作用力为引力 也形成两个水相 但两种高聚物都分配于一相 另一相几乎为溶剂 作用力没有强烈的引力或斥力 完全互溶 形成均相的高聚物水溶液聚合物的不相容性 两种聚合物分子间存在斥力 在达到平衡后 分成两相 两种聚合物分别进入到一相中 高聚物与高聚物形成两相是由于高聚物的不相容性高聚物与无机盐溶液也能形成两相 这是由于盐析作用 生化工程中 多应用聚乙二醇 葡聚糖和聚乙二醇 无机盐系统 双水相系统 PEG 聚已二醇Kpi 磷酸钾DX 葡聚糖 双水相萃取 利用生物大分子在两种水相之间的分配比例不同而达到分离纯化生物大分子的目的 二 相图 两种高聚物的水溶液 当它们以不同的比例混合时 可形成均相或两相 这种水性两相的形成条件和定量关系 常用相图来表示 它是一条双节线 只有当P和Q达到一定浓度才能形成两相 双节线 系线 具体的证明过程省略 系线的长度是衡量两相间差别的尺度 系线越长两相间的差别越大 反之越小 当系线向下移动时 长度逐渐减小 这说明两相的差别减小 当达到K点时 系线的长度为0 两相间差别消失 点s成为临界点 三 分配理论 和溶剂萃取法一样 蛋白质在两水相间的分配 有分配系数K C1 C2C1代表上相浓度 C2代表下相浓度 当相系统固定时 分配系数为一常数只取决于被分离物质本身的性质和特定的双水相体系 与蛋白质的浓度无关 当物质进入双水体系后 由于表面性质 电荷作用和各种力 如憎水键 氢键和离子键 的存在和环境的影响 物质在上相和下相间进行选择性分配 四 影响物质分配平衡的因素 主要有聚合物的分子量和浓度 pH 演的种类和浓度 温度等 适当的选择各参数即在最适条件下 可达到较高的分配系数和选择性 当聚合物相对分子质量降低时 蛋白质易分配于富含该聚合物的相中 例如 PEG DX系统中当PEG的分子量降低时 会使蛋白质易分配于富含该PEG的相中 使分配系数增大 而葡聚糖的分子量减小 会使分配系数降低 这是一条普遍规律 成相聚合物的相对分子质量 这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲水性物质的分配产生较大的影响 同一聚合物的疏水性随分子量的增大而增大 当PEG的分子量增加是 在质量浓度不变的情况下 其两端羟基数减少 疏水性增加 亲水性的蛋白质不再向富含PEG相中聚集 而转向另一相 那么 分子量降低时 蛋白质就易分配于富含PEG的相了 当接近临界点时 上相和下相的组成相同蛋白质均匀的分配于两相中 分配系数接近于1 当成相系统的总浓度增大时 系统远离临界点 系线长度增加 两相性质的差别增大 蛋白质分子的分配系数 分配系数为一常数只取决于被分离物质本身的性质和特定的双水相体系 与蛋白质的浓度无关 就会偏离临界点的值 1 即大于1或小于1 成相聚合物的浓度 在双水相聚合物系统中 加入电解质 首先阴阳离子会有不同的分配 盐的正负离子在两相间的分配系数不同 由于各相应保持电中性 因而在两相中形成电位差 这对带电生物大分子的分配 产生很大的影响 盐类的影响 K 1分配在上相K 1分配在下相 在pH6 9时溶菌酶带正电 卵蛋白带负电 当加入NaCl时 其浓度低于50mmol L时可见上相电位低于下相电位 使溶菌酶分配在上相 从而分配系数增大 而卵蛋白的分配系数减小 结论 加入适当的盐类 会大大促进带相反电荷的生物大分子的分离 pH值对分配的影响源于两个方面的原因 一 pH值会影响蛋白质中可以解离基团的解离度 因而改变蛋白质所带的电荷和分配系数 pH 二 pH值会影响磷酸盐的解离程度 改变H2PO4 和HPO42 之间的比例 而影响分配系数 pH的微小变化会使蛋白质的分配系数改变2 3个数量级 温度影响相图 特别在临界点附近 因而也影响分配系数 温度越高发生相分离所需的高聚物浓度越高 温度 应用 工业方面小分子分离和纯化技术的新发展 双水相萃取系统的优点 直接从cell碎片匀浆中萃取prot 而无需将细胞碎片分离双水相系统平衡时间短 含水量高 界面张力低 成相聚合物对蛋白质有稳定作用 为生物活性物质提供了温和的分离环境操作简便 经济省时 易于放大 由于很容易达到平衡 用商业上的离心机能使相分离完全 分配系数的值重演性很好 故可直接放大改变体系的pH和电解质浓度可进行反萃取 工艺方面 应用范围 胞内酶的提取 双水相系统可用于除去细胞破碎后的匀浆液中的碎片以及酶的进一步精制 运用双水相法萃取需满足的条件 1 欲提取的酶与细胞分配在不同的相中 2 酶的分配系数足够大 使在一定的相体积比时 经过一次萃取就能得到较高的收率 3 两相用离心机很易分离 通常将蛋白质分配在上相 而细胞碎片分配在下相 盐 合理调整双水相组成 从实用角度看 碎片分配在下相的好处多 Y 100 目标蛋白质在上相的收率 Y 为 实际上最困难的是如何在保证碎片分配在下相的同时 把蛋白质产物尽可能完全地分配在上相 实验证明 在大多数场合下 收率Y都能达到90 分配系数在2 20之间 多数场合大于3 很多杂蛋白也能同时除去 单位质量相系统中匀浆液的加入量 经济上考虑希望越多越好 但若匀浆液太多会影响原来成相聚合物的相系统 改变相比或者使分配系数降低 根据Kula的经验 一般取一千克萃取系统处理200到400克湿菌体为宜 PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐 有时也可加入适量的PEG 尽兴第二次双水相萃取 以除去多糖和核酸 它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中 而蛋白质就留在了PEG相中 在第三步萃取中 应该使蛋白质分配在盐相中 例如 调节pH 以使和主体PEG分离 色素由于其疏水性 通常分配在上相 主体PEG可循环使用 而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残余的PEG以提高产品的纯度 三步两水相萃取酶的流程 细胞匀浆液 第一步双水相萃取 PEG 盐 或是葡聚糖 分离机 下相上相 PEG相 细胞碎片 目标产物 如prot E 杂蛋白 盐 核酸 多糖 第二步双水相萃取 下相 盐相 上相 PEG相 核酸多糖目标产物 静置分层 杂蛋白 盐 亲水性较强 第三步双水相萃取 静置分层 下相 盐相 上相 目标产物 PEG 杂蛋白 色素 UF PEG可循环使用 提纯产品 多步萃取的目的是为了获得较高的纯化倍数 小分子分离和纯化 1990年科研人员发现在PEG 磷酸盐系统中 某些氨基酸和青霉素的分配是不均匀的 例如 赖氨酸的分配系数为0 23 而类黑素的分配系数为7 1 从而可将二者分离 引起人们利用双水相分配分离纯化小分子的兴趣 特别应用于从一些粘度大 难过率 易乳化的发酵液中提取 分离纯化小分子同样的也利用的是PEG 盐系统 双水相萃取技术的进展 廉价双水相体系的开发 两种双水相体系的比较 双水相萃取技术同其他分离技术相结合 A 双水相体系同生物转化相结合 B 双水相萃取同膜分离技术相结合 C 双水相萃取同亲和层析相结合 亲和萃取 亲和分配 亲和分配 蛋白质在两水相系统中的分配系数一般不是很大 为了提高分配系数和萃取效率 可将亲和层析与两水相萃取结合起来 成为亲和萃取或亲和分配 即把一种配基与一种成相聚合物以共价相结合 使该配基随成相聚合物分配在某一相中 配基可也是酶的底物 抑制剂 抗体 受体或染料等 对目标蛋白质有很强的生物亲和力 因而使后者倾向于分配在配基 聚合物的相中 通常选择在PEG上接上配基 当配基 PEG的浓度增加时 蛋白质的分配系数也增加 当蛋白质的结合位点都为配基所占据时 即达到饱和 蛋白质的分配系数达到极大值 两水相生物转化 原理 在双水相系统中进行转化反应 如酶促反应 可以把产物一如另一相中 消除产物抑制 因而可提高效率 实际上是一种反应和分离耦联的过程 亦称为萃取生物转化 如果发生的是一种发酵过程 也可成为萃取发酵 反应应满足的条件 1 催化剂