香蕉凝集素BanLec基因转化毕赤酵母及转化子的鉴定.pdf

研究报告 生物技术通报 B l o T E c H N o L o G YB U L L E T I N2 0 1 0 年第6 期 香蕉凝集素B a n L e c 基因转化毕赤酵母及转化子的鉴定 陈石1 2李春雨2郑加协1周红玲1 颜元培1 方志坚1易干军2 1 福建省农业科学院闽台园艺研究中心 漳州3 6 3 0 0 5 2 广东省农业科学院果树研究所 广州5 1 0 6 4 0 摘要 以p M D B a n L e c 质粒为模板扩增B a n L e c 基因片段 该片段经E c o RI X b aI 双酶切后定向克隆到同样经E c o RI X b aI 双酶切的p P I C Z a 表达栽体上 将连接产物转化感受态D H 5 a 用低盐Z e o c i n 抗性L B 固体培养基筛选阳性克隆茵落 将重组质粒电转化毕赤酵母茵G S l l 5 后 通过P C R 签定目的基因整合入酵母菌的基因组中 将有助于进一步研究B a n L e c 蛋 白的表达 为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础 关键词 香蕉香蕉凝集素基因表达栽体毕赤酵母 B a n L e cT r a n s f o r m e di n t oP i c h i ap a s t o r i s a n da n d I d e n t i f i c a t i o no ft h eT r a n s f o r m a n t s C h e nS h i l 2L iC h u n y u 2 Z h a n gJ i a x i e l Z h o uH o n g l i n 9 1V a nY u a n p e i l F a n gZ h i j i a n l Y iG a n j u n 2 1 F u j i a n T a i w a nH o r t i c u r eR e s e a r c hC e n t e r F u j i a nA c a d e m yo f A g r i c u l t u r a lS c i e n c e s Z h a n g z h o u3 6 3 0 0 5 2 I n s t i t u t i o no f F r u i tT r e eR e s e a r c h G u a n g d o n gA c a d e m y 矿A g r i c l d t u r a lS c i e n c e s G u a n g z h o u5 1 0 6 4 0 A b s t r a c t B a n L e cf r a g m e n tw a ga m p l i f i e db yP C Rf r o mp M D B a n L e cv e c t o r t h e nt h ep r o d u c tw a sd i g e s t e db yE c o RI X b aIt o o b t a i nB a n L e ef r a g m e n t t h ef r a g m e n tw a sc l o n e di np P I C Z c tt of o r mp P I C Z a B a n L e cr e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r A f t e rE c o l i D H 5 aW S gt r a n s f o r m a t e db yp P I C Z a B a n L e cv e c t o r p o s i t i v ec l o n i n gs t r a i n sw e r es e l e c t e db yl o ws a l tL Bm e d i u mw i t hZ e o c i na n di d e n t i f i c a t e db yr e s t r i c t i o na n a l y s i sb yE c o RI X b aI T h eP C Rr e s u l ts h o w e dt h a tr e c o m b i n a n tp l a s m i dp P I C Z a B a n L e cW 8 8t r a n s f o r m e di n t oG S l l 5b ye l e c t r o p o r a t i o n T h er e s u l t sl a i daf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d yO Rt h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fB a n L e ea n dw e r eh e l p f u lf o ri n v e s t i g a t i n gt h ea c t i v i t i e so ro t h e rp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n so fB a n L e c K e yw o r d s B a n a n aB a n L e cg e n e E x p r e s s i o nv e c t o r P i c h i ap a s t o r i s 植物凝集素是指能可逆结合特异单糖或寡糖的 蛋白质 自1 8 8 8 年S t i l l m a r k 首次发现了蓖麻凝集 素以来 人们已经发现了10 0 0 多种植物凝集素旧1 P e u m a n s 等 1 首次从香蕉中分离了凝集素 简称 B a n L e c 香蕉凝集素是由两个相同的1 5k D 亚基构 成的二聚体 可使兔红细胞发生凝集并对甘露糖具 有特异性 B a n L e c 基因与菠罗蜜凝集素 简称J a c a l i n 相关凝集素家族的凝集素基因有序列相似 性H 大量存在于成熟香蕉果实中的甘露糖特异 的J a c a l i n 相关凝集素引发了人们对这些活性蛋白 功能的思考 一些半乳糖结合的J a c a l i n 相关凝集 素亚家族的成员具有抗病虫特性 但是关于甘露糖 特异的J a c a l i n 相关凝集素的功能目前知之甚少 B a n L e c 是否是抗病虫蛋白尚存疑问 另外 这些凝 集素的天然多糖受体也十分重要 因为只有3 种甘 露糖特异的J a c a l i n 相关凝集素被定性 而且进一步 的证据表明虽然具有高度的序列相似性 这些凝集 素却各具特性和不同的生物活性 因此对B a n L e c 蛋 白功能的鉴定与分析是很有必要的 1 材料和方法 1 1 材料 质粒和酵母菌 p M D B a n L e c 质粒由本人构建 收稿日期 2 0 1 0 一O l 一1 9 基金项目 农业部公益性行业科研专项 n y h y z x 0 7 0 2 9 农业部 9 4 8 项目 2 0 0 8 一G 1 国家科技支撵项目 2 0 0 8 B A D 9 2 8 0 6 福建省科技项目 2 0 0 9 R 1 0 0 3 1 作者简介 陈石 男 研究实习员 硕士 研究方向 果树生物技术 E m a i l c h e n s h i 0 7 5 9 1 6 3 c o i n 通讯作者 易干军 男 研究员 博士 研究方向 果树生物技术 E m a i l y i g a n j u n r i p 1 6 3 c o r n 万方数据 生物技术通报B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n 2 0 1 0 年第6 期 p P I C Z a A 表达载体和毕赤酵母菌G S l l 5 为I n v i t r o g e n 公司产品 主要试剂 限制性内切酶 T a qD N A 聚合酶 T D N A 连接酶 核酸分子量标准均购自 T a K a R a 公司 D N A 片段回收试剂盒 B 型质粒小 量提取试剂盒均购自北京博大泰克生物基因技术有 限公司 1 2方法 1 2 1 引物设计与合成根据p M D B a n L e c 克隆 载体上的B R n L e c 基因和p P I C Z a 载体的多克隆位点 的情况 设计合成5 端上游引物P 1 5 G C A G A A T T C T A T G A A C G G A G C G A T C 一3 下划线为含有E c o RI 酶切位点 3 端下游引物P 2 57 一T G T T C T A G A T A T G G C T C C A A G T A G 一3 下划线为含有X b aI 酶切位点 根据p P I C Z a 载体设计酵母转化子检测引物 57 端上 游弓I 物P 3 5 G A c T G G T T C C A A 7 I v I G A C A A G C 一3 3 端下游引物P 4 5 G C A A A T G G c A T T C T G A c A T c C 一 3 引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成 1 2 2 目的基因B a n L e c 的制备和鉴定以p M D B a n L e c 质粒为模板 在引物P 1 P 2 引导下通过P C R 扩增获得B a n L e c 基因片段 经E c o RI X b aI 双酶 切 琼脂糖电泳鉴定后 用D N A 片段回收试剂盒回 收 获得具有黏性末端的B a n L e c 基因片段 1 2 3 p P I C Z a B a n L e c 重组表达载体的构建1 E c o RI X b aI 双酶切p P I C Z a 载体 回收获得具有黏 性末端的p P I C Z x 基因片段 2 连接线性化的B a n L e c 和p P I C Z o t 用C a C I 转化法将连接产物转化感 受态D H 5 a 用低盐Z e o c i n 抗性L B 固体培养基筛选 阳性克隆菌落 1 2 4 p P I C Z a B a n L e c 重组表达载体的酶切鉴定 从5 个阳性克隆菌中 提取2 个阳性克隆的质粒 D N A 进行酶切分析 用1 2 琼脂糖凝胶电泳 鉴定 1 2 5 酵母菌转化和筛选鉴定制备酵母菌 G S l l 5 感受态 将1 0 0 LG S l l 5 感受态和5 1 0 g 经S a cI 线性化的重组表达质粒p P I C Z a B a n L e c 转入0 2c m 电转杯 通过电转化 电压1 5k V 电 容2 5 斗F 电阻2 0 0Q 电激时间为4 1 0m s e c 将 其导入感受态G S I1 5 酵母菌中 取转化菌涂布于 含有1 2 0m 窑 LZ e o c i n 的Y P D S 平榍卜一千3 n 甲泪 箱中培衰 液体培养基中 于3 0 培养2 0 一2 4h 离心收集 菌体 提取酵母菌基因组D N A 并以此为模板 通 过P C R 鉴定目的基因是否整合入酵母菌的基因 组中 2 结果与分析 2 1 P C R 扩增产物B a n L e c 片段的鉴定 以p M D B a n L e c 质粒为模板 在P 1 P 2 引导下 P C R 扩增获得大小约4 2 0b p 的基因片段 与预期结 果相符 图1 将其产物进行测序 结果进一步表明 扩增到的片段为B a n L e c 基因 1 B a n L e c 摹园的P C R 严物 M 2 0 0b pm a r k e r 图1P C R 扩增产物B a n L e c 的鉴定 2 2 B a n L e c 基因回收产物和p P I C Z a 质粒的酶切 对B a n L e c 基因回收产物和p P I C Z a 质粒分别用 E c o RI X b aI 双酶切后 分别获得大小约为4 2 0b p 和3 6k b 的D N A 片段 与预期产物大小相符 图 2 1 p P I C Z a A 质粒酶切产物 2 B m a L e e 基因爵切严物 M 2 0 0b pm a r k e r 图2 E c o RI X b aI 双酶切产物的鉴定 2 3 p P I C Z a B a n L e c 重组表达栽体的鉴定 p P I C Z c t B a n L e c 重组表达载体用E c o RI 舶口I 双酶切后 在琼脂糖凝胶电泳中出现两条大小约为 万方数据 2 0 1 0 年第6 期 陈石等 香蕉凝集素B a n L e c 基因转化毕赤酵母及转化子的鉴定1 2 3 3 6k b 和4 2 0b p 的D N A 片段 与预期结果相符 图 3 1 2 p P I C Z a B a n L e c 重组质粒的E c o RI 和X b al 双酶切 M 2 0 0b pm a r k e r 图3 p P I C Z a B a n L e c 重组质粒的酶切鉴定 2 4 酵母阳性重组子P C R 鉴定 分别以P 1 和P 4 P 1 和P 2 为引物 以筛选出的 酵母重组子D N A 为模板进行P C R 鉴定 预期目的 片段大小分别约为6 0 0b p 和4 2 0b p 图4 电泳 检测结果发现P C R 扩增出的片段与预期片段大小 相符 这证明目的片段已经整合到酵母基因组中 究 将香蕉枯萎病菌接种香蕉果实表明 果实具有 很强的抗菌能力 镰刀菌并不能在果实里繁殖 但香 蕉果实中是哪种物质能抑制香蕉枯萎病菌目前还不 清楚 金志强等 1 研究了B a n L e c 基因的表达同时 具有发育特异性和组织特异性 即仅在果实中表达 其他发育阶段和器官不合成这种蛋白质 而且其表 达量随果实成熟度的变化而变化 因此推断它可能 与香蕉果实发育阶段的防御性有关 陈石等 1 克 隆了香蕉果实凝集素基因 并对其进行了原核表达 原核表达是能够在较短时间内获得基因表达产物 且所需的成本相对较低 但原核表达还存在许多难 以克服的缺点 如目的蛋白常以包涵体形式表达 致 使产物纯化困难 原核表达系统翻译后加工修饰体 系不完善 表达产物的生物活性较低等 而真核系 统具有翻译后的加工修饰体系 表达的外源蛋白更 接近于天然蛋白质 一 因此 利用真核表达系统来 表达目的蛋白越来越受到重视 笔者将B a n L e c 基 因转化至毕赤酵母 将有助于进一步研究B a n L e c 蛋 白的表达 揭示香蕉凝集素在植物防御及其它理化 性质和结构功能 并为植物抗病 虫基因工程提供有 用的素材 参考文献 1 L i sH S h a r o nN L e c t i n s m o l e c u l e sa n dt o o l s A x m uR e vB i o e h e m 1 9 8 6 5 5 3 5 6 7 2 舒晓燕 阮期平 侯大斌 植物凝集素的研究进展 现代中药研究 与实践 2 0 0 6 2 0 6 5 3 5 6 3 P e u m a n sW J Z h a n gW B a r r eA e ta 1 F r u i t s p e c m cl e e t i n s l 2 P l 和P 4 引物扩增酵母莺组子 3 P 1 和P 4 引物 f r o mb a n a n aa n dp l a n t a i n P l a n t s 2 0 0 0 2 1 l 4 5 4 6 5 4 扩增p P I C Z a B a n L e e 4 5 分别用P l 和P 4 及P l 和P 2 4 C l e n d e n n e nS K M a yG D D i f f e r e n t i a lg e n ee x p r e s s i o ni nr i p e n n g 引物扩增酵母D N A 6 7 P 1 和P 2 引物扩增酵母重组子 b a n a n af r u i t P l a n tP h y s i o l o g y 1 9 9 7 i 1 5 4 6 3 4 6 9 8 P l 和P 2 引物扩增p P I C Z a B a n L e c M 2 0 0b pm a r k e r 5 王志斌 李学勇 郭三堆 植物凝集素与抗虫基因工程 生物技 图4毕赤酵母转化子的P C R 鉴定 术通报 1 9 9 8 2 5 9 6 金志强 张德有 徐碧玉 香蕉凝集紊基因的克隆及在成熟果实 3 讨论 中的特异性表达 遗传学报 2 0 0 4 3 1 5 5 0 8 5 1 2 具有结合几丁质能力的凝集素能够抑制真菌孢 7 陈石 李春雨 孙清明 等 香蕉果实凝集索基因的克隆及原核 子萌发及菌丝生长 具有强烈的抗真菌能力 1 但 表达 中国农学通报 2 0 0 9 2 5 1 2 3 0 3 3 香蕉凝集素的理化性质和结构功能 目前还很少研 郭广君 吕索芳 王荣富 外源基因表达系统的研究进展 科 学技术与工程 2 0 0 6 6 5 5 8 2 5 9 2 万方数据 香蕉凝集素BanLec基因转化毕赤酵母及转化子的鉴定香蕉凝集素BanLec基因转化毕赤酵母及转化子的鉴定 作者 陈石 李春雨 郑加协 周红玲 颜元培 方志坚 易干军 Chen Shi Li Chunyu Zhang Jiaxie Zhou Hongling Yan Yuanpei Fang Zhijian Yi Ganjun 作者单位 陈石 Chen Shi 福建省农业科学院闽台园艺研究中心 漳州 363005 广东省农业科学院果树 研究所 广州 510640 李春雨 易干军 Li Chunyu Yi Ganjun 广东省农业科学院果树研究 所 广州 510640 郑加协 周红玲 颜元培 方志坚 Zhang Jiaxie Zhou Hongling Yan Yuanpei Fang Zhijian 福建省农业科学院闽台园艺研究中心 漳州 363005 刊名 生物技术通报 英文刊名 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年 卷 期 2010 6 参考文献 8条 参考文献 8条 1 Lis H Sharon N Lectins as molecules and tools 1986 2 舒晓燕 阮期平 侯大斌 植物凝集素的研究进展 期刊论文 现代中药研究与实践 2006 6 3 Peumans WJ Barre A Astoul CH Balint Kurti PJ Rovira P Rouge P May GD Van Leven F Truffa Bachi P Van Damme EJM Zhang WL Fruit specific lectins from banana and plantain 外文期刊 2000 4 4 Clendennen SK May GD Differential gene expression in ri