潘景轩-合肥肿瘤-肿瘤干细胞会议

潘景轩 中山大学,2015.11.27,酪氨酸激酶抑制剂Imatinib耐药克服策略研究,肿瘤治疗,传统药物：选择性差, 毒副作用大靶向药物：选择性好, 毒副作用小,分子靶向治疗,引起肿瘤发生的起始原因和继续牵引力量肿瘤细胞高表达;正常细胞不/低表达,基因修补/干预单克隆抗体小分子化合物: 可控,可穿透胞膜,作用快,排谢快。 Gleevec (STI571, 格列卫),靶点:,攻击手段:,慢性粒细胞性白血病(CML),1960，Peter Nowell 和David Hungerford CML “费城染色体”，见于-95%CML。1973，染色体易位t(9,22)。,Janet Rowley,1985, CML病人，Bcr-Abl cDNA,Bcr-Abl酪氨酸激酶,Ras,Raf,MEK,Erk,AKT,PI3K,mTOR,Stat3,Stat5,Regulation of gene transcription(Mcl-1, Bcl-XL, cyclin D1),Nucleus,Cytoplasmic,Bcr-Abl,Cell proliferation, Survival, Oncogenesis,Membrane,Bcr-Abl CML治疗的靶点,Bcr-Abl是引起CML的起始原因(1990)：,CML细胞生长是否继续依赖 Bcr-Abl？,人的Bcr-Abl cDNA转染正常骨髓细胞，回输给正常小鼠，发生类CML 转Bcr-Abl基因小鼠发生类CML,Brian Druker,1995年12月ASH年会，Brian Druker做了报道。,1993，发现其中一个小分子化合物 STI571 (Signal Transduction Inhibition)在体外选择性地杀死 90%的CML细胞而不杀伤正常细胞。,STI571小分子化合物的发现,1990，Ciba-Geigy制药公司Alex Matter等研制小分子化合物抑制PKC。,How Does STI571 Work?,Kinase: Bcr-Abl,STI571,1996年，狗, 对肝有毒1997年，合适的剂量, 猴子,对肝无毒。 1997年，Peter Graf研究出了STI571的口服制剂 配方，取代静脉注射法。,STI571小分子化合物的发现,I期临床试验,1998年6月，Druker，Charles Sawyers及Moshe Talpaz等人共同执导I期临床试验。 CML病人入组的标准：干扰素治疗（传统治疗）失败，不适合骨髓移植，处于慢性期。Gleevec (STI571)，25 mg/d起，每月增加剂量。200-300 mg/d，CML外周血白细胞下降，5个月后，病人骨髓Bcr-Abl阳性细胞减少到检测不出的水平 。至1999年夏共招募了149例CML，90%有效。,Gleevec,Gleevec was FDA-approved as first-line therapy for CML,Gleevec, imatinib mesylate, STI571,酪氨酸激酶抑制剂Gleevec: 成就,Its a milestone because Gleevec is the first small-molecule drug that works by targeting the specific biochemical defect that causes the cancer.,2001年世界十大科技突破之一Breakthrough Of The Year, Dec 2001,Gleevec (STI571, 格列卫)靶点: Bcr-Abl c-KIT PDGFR 里程碑 新纪元慢粒白血病等临床一线用药临床治疗: 95%有效,Gleevec获得性耐受重大挑战,14,靶基因突变,靶基因扩增,靶基因非依赖性肿瘤克隆形成,其他,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,靶蛋白分子构象改变,Bcr-Ablc-KITPDGFR,靶蛋白高表达,Gleevec耐受,新化合物,肿瘤干细胞,15,2nd-generation TKIs are not effective against Gleevec-resistance due to “gate-keeper”point mutations,Dasatinib,Nilotinib,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,T315I D816V T674I,根据激酶活性中心计算机辅助合理药物设计,化合物文库,计算机模拟筛选,合成,小分子化合物来源,生物学活性检测与药效学研究,先导化合物,靶基因突变,靶基因扩增,靶基因非依赖性肿瘤克隆形成,其他,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,靶蛋白分子构象改变,Bcr-Ablc-KITPDGFR,靶蛋白高表达,Gleevec耐药,新化合物,T315I D816V T674I,EXEL-0862: 克服Gleevec耐受的新化合物发现：能结合并抑制D816V c-KIT和T674I PDGFR 杀伤携带有突变体酪氨酸激酶的肿瘤细胞意义：为相关白血病患者治疗提供一种可能的新药研制新结构的化合物克服Gleevec耐受的策略可行第一作者:Blood 2007Leukemia 2007,18,18,基于酪氨酸激酶的结构，利用计算机辅助药物设计、合成了结构全新的噻唑胺类化合物和芳基炔类化合物（目前已累计1000余种）,19,19,能克服Gleevec耐药的新结构化合物,S116836,126332,126349,(1) GZD824 J Med Chem 2013 (2) S116836 Oncotarget 2014, Cancer Biol Ther 2014 (3) 126332和126349 Cancer Lett 2014 (4) Ponatinib Mol Cancer Ther 2014, Mol Cancer 2014 (5) DCC-2036 PloS One 2013 (6) SNS-032 Clin Cancer Res 2012,GZD824抑制T315I Bcr-Abl,GZD824, S116836,J Med Chem 2013,性状：白色或微黄色粉末状晶体熔 点：158-160 C分子量：532.56 （724.77，甲磺酸盐）中国发明专利申请号：201010216603.7 ；200910193571.0 PCT申请：2011最大吸收波长：285nm3nm,GDZ824,IC50 (nM),与丁克教授合作,T315I Bcr-Abl CML,21,21,能克服Gleevec耐药的新结构化合物,S116836,126332,126349,(1) GZD824 J Med Chem 2013 (2) S116836 Oncotarget 2014, Cancer Biol Ther 2014 (3) 126332和126349 Cancer Lett 2014 (4) Ponatinib Mol Cancer Ther 2014, Mol Cancer 2014 (5) DCC-2036 PloS One 2013 (6) SNS-032 Clin Cancer Res 2012,22,S116836抑制PDGFR及其下游信号通路,A,B,23,23,S116836抑制PDGFR突变体耐药细胞的增殖,细胞活力,克隆形成能力,24,24,S116836诱导PDGFR突变体耐药细胞的凋亡,B,25,25,S116836的药物代谢动力学研究,S116836大鼠的生物利用度为35.3%。,26,26,S116836诱导凋亡的关键蛋白-BH3-only蛋白Bim,A,B,27,27,S116836诱导Bim上调的机制,C,D,E,28,28,S116836的体内抗肿瘤作用,通讯作者: Oncotarget. 2014,29,29,能克服Gleevec耐药的新结构化合物,S116836,126332,126349,(1) GZD824 J Med Chem 2013 (2) S116836 Oncotarget 2014, Cancer Biol Ther 2014 (3) 126332和126349 Cancer Lett 2014 (4) Ponatinib Mol Cancer Ther 2014, Mol Cancer 2014 (5) DCC-2036 PloS One 2013 (6) SNS-032 Clin Cancer Res 2012,30,126332能克服D816V KIT引起的Gleevec耐药,A,B,C,D,通讯作者：Cancer Lett. 2014.,根据激酶活性中心计算机辅助合理药物设计,化合物文库,计算机模拟筛选,合成,小分子化合物来源,生物学活性检测与药效学研究,先导化合物,Structure of triptolide,Tripterygium wilfordii Hook. f.,靶基因突变,靶基因扩增,靶基因非依赖性肿瘤克隆形成,其他,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,靶蛋白分子构象改变,Bcr-Ablc-KITPDGFR,靶蛋白高表达,Gleevec耐受,T315I D816V T674I,翻译后,转 录,翻 译,抑制剂,意义：,为相关肿瘤的治疗提供了一种可能的新途径提示通过抑制基因转录克服Gleevec耐受是有效的策略,通讯作者:Cancer Sci. 2009Cancer Sci. 2009Cancer Lett. 2010,D816V C-KIT胃肠间质瘤T674I PDGFR高嗜酸白血病V617F JAK2 骨髓增殖病(MPD),克服Gleevec耐受: 抑制转录,发现：Triptolide杀伤下列点突变体引起的Gleevec耐受,对Triptolide进行了结构改造和优化,Celastrol,Tripterygium wilfordii Hook. f.,基因突变,基因扩增,肿瘤干细胞,其他,Bcr-Abl c-KIT PDGFR,靶蛋白分子构象改变,Bcr-Ablc-KITPDGFR,靶蛋白高表达,翻译后,Gleevec耐药,转 录,翻 译,新化合物,抑制剂,T315I D816V T674I,化疗耐受、肿瘤复发的根源：肿瘤干细胞,肿瘤干细胞的特性：,自我更新增殖和分化潜能静止状态,问题：迫切需要寻找能杀伤肿瘤干细胞的药物。,靶基因突变,靶基因扩增,旁路机制: 靶基因非依赖性肿瘤克隆形成,其他,50%,Bcr-Abl,驱动细胞生长,Y,Z,X,imatinib耐药机制,肿瘤干细胞,PARP,Actin,Pro-caspase 3,Active Caspase 3,PJ6038 36 h,KBM5,KBM5-T315I,C,10,25,50 nM,C,10,25,50 nM,Cyto C,Actin,AIF,KBM5,KBM5-T315I,C,10,25,50 nM,C,10,25,50 nM,PJ6038 36 h,KBM5,KBM5-T315I,C,10,25,50 nM,C,10,25,50 nM,Survivin,Bcl-2,Bcl-XL,XIAP,Actin,Bim,Mcl-1,小分子探针PJ6038抑制CML耐药细胞增殖、诱导凋亡,PJ6038 36 h,42,Input biotin biotin-PJ6038,Western blotting,-catenin 是小分子探针PJ6038的结合蛋白,A,B,C,K562,C 0.25 0.5 1.0 M,Actin,Bcr-Abl,D,-catenin,43,NBM,CML,#1 #2 #3 #1 #2 #3,Actin,B,-catenin 在白血病干/祖细胞 (CML CD34+ )中高表达,A,-catenin,CD34+ cells,44,PJ6038诱导CML 干/祖细胞凋亡并增加其对Gleevec的敏感性,A,45,CML #3,0 1.0 0 1.0 0 1.0,Bcr-Abl,-catenin,Actin,CML #1,CML #2,PJ6038, M,CD34+ cells,B,每周半量换液2次，5周后收集细胞，种植在甲基纤维素培养基中,PJ6038降低CML 干/祖细胞的自我更新能力（LTC-IC）,CML BM 标本,80 Gy,用探针处理1周,long-term culture-initiating cell (LTC-IC) medium,2-3周计数克隆数目,Quantitation of LTC-IC using Bulk Cultures,*,*,*,*,*,*,PJ6038降低CML 模型小鼠骨髓中LSK 细胞的比例,骨髓,沉默-catenin诱导 CML 干/祖细胞凋亡,A,B,Control,sh r-catenin #1,sh r-catenin #2,Without Gleevec,With Gleevec,Annexin V-FITC,CD38-PE,48,*,*,*,*,*,*,Control, -catenin shRNA,沉默-catenin 降低CML 模型小鼠骨髓中LSK 细胞的比例,骨髓,Self-renewal,-catenin,leukemia progenitor cells,differentiation,myeloid Leukemia,CML stem cells,PJ6038,Gleevec,Bcr-Abl,HSC,Normal hematopoietic stem cells,LSC,50,第二代TKIs: nilotinib, dasatinib