稳定转染细胞系的一般建立方法.doc

精品文档转染克隆的G418筛选和分离对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA（通过稳定或永久转染）的细胞系来说，理想的是使用选择标记，通常也是必要的。虽然有许多标记可利用，但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。G418是一种氨基糖苷类似物，在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生G418的解毒作用。这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导，特殊条件由研究者个人决定。1. 建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度（参考建立方法见附录）；2. 细胞铺板：转染后24小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控制细胞密度，不能使细胞太密集，应该少于生长表面的50%，参考为20%-30%）至15cm培养皿，加入1520ml培养基（DMEM，含血清）进行培养；3. 用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选：铺板完成后，再过24小时，抗性表达，用最佳筛选浓度的G418进行筛选（对于Hela细胞，一般筛选终浓度为800ug/ml）。具体操作是去除旧的培养基，用PBS洗一次，将含有浓度为800ug/ml（以Hela为例）的培养基1520ml加入培养皿内即可；4. 换液：每日及时观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度（800ug/ml）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死亡大部分（至少30%以上）；5. 撤药维持阶段：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用培养基含G418的终浓度为200ug/ml（维持浓度），维持生长（若细胞仍有死亡，需要继续降低药的浓度，参考为50-100ug/ml），直至筛选克隆可见为止（大约23天）；6. 分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性），减少单个克隆受其他细胞污染的机会。具体操作是：a.用PBS洗含有克隆的培养物，圈出欲分离的克隆。从培养皿中除去液体，准备24孔板收集克隆；b.从培养皿中用牙签或者棉棒（经过高压）挑取已分离出的克隆（具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶，再蘸一下克隆）；c.在24孔板的一个孔中（事先已加入完全培养基，不含G418）剧烈摇动牙签，使细胞沉于孔中，继续挑取下一个克隆；7. CO2孵箱，温育细胞约两小时；8. 两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着。如果已经附着，用新鲜完全培养基（含50ug/ml G418）更换24孔板培养基，除去残留的胰蛋白酶，继续培养直到培养物长满；9. 一旦小量培养物长满，转接到大的培养皿（通常先是6孔板），用50ug/ml的新鲜完全培养基维持培养，然后与同样类型的其他细胞一样处理即可。 附录：死亡曲线建立方法1. G418的配制：取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中，加蒸馏水至10ml，过滤除菌，4保存；2. 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h左右开始加药；3. 制备筛选培养基：在1001000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100、400、800、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基；4. 加G418筛选：吸除培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基；5. 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每隔35d更换一次筛选培养基；6. 确定最佳筛选浓度：在筛选1014d内能够杀死所有细胞