丹参注射液、肉毒素及二者联合

,丹参注射液、肉毒素及二者联合治疗神经病理性疼痛的实验研究,何明伟首都医科大学宣武医院疼痛科,1,神经病理性疼痛 神经病理性疼痛是神经系统损伤引起的一种难以治疗的慢性状态发病机制复杂、治疗困难，常规治疗药物（如阿片类镇痛药和非甾体类抗炎药）均无明显疗效。,项目的国内外最新研究进展,2,外周和中枢发生机制主,1、外周性致敏2、神经元异位放电3、中枢性致敏,3,一 外周性致敏,外周的损伤导致炎症介质和其他组织产物如5-羟色胺、缓激肽、花生四烯酸、三磷酸腺苷、神经生长因子等短期作用于初级伤害性感受器，通过直接激活伤害性感受器产生疼痛长期致敏伤害性感受器，使之对伤害性和非伤害性刺激均产生疼痛，这一过程即外周性致敏。,4,二 神经元异位放电,多项研究证实，在不同的神经损伤模型中存在电压依赖性钠通道功能失调，进而导致受损神经元的轴突和胞体产生过度兴奋和异位放电。钾通道表达降低会进一步提高细胞膜兴奋性，这些将产生非刺激依赖性疼痛。,5,三 中枢性致敏,中枢性致敏源于C纤维的反复放电，这将导致N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）谷氨酸受体磷酸化，增强NMDA受体兴奋性中枢性致敏包括痛觉异常（降低诱发疼痛的感觉域值）；痛觉过敏（背角神经元对阈上刺激的反应过强）；继发性痛觉过敏 (激活某神经元的外周区域扩大)。,6,治疗现状,口服药物：三环类抗抑郁药、抗癫痫药、阿片和非阿片类止痛药等等，其疗效多不尽满人意，且有全身副作用，不能有效改善患者的生活质量试验阶段：基因失活、基因增补、阻断离子通道、神经营养因子及电穿刺技术等,7,丹参注射液,主要为丹酚酸和丹参酮 具有抗氧化、抗菌、抗炎及内分泌调节等作用,8,丹参的药理作用,对脊髓的作用：丹参能改善脊髓微循环，提高脊髓组织耐缺氧能力，抑制胶原细胞浸润（在脊柱矫形术前应用丹参具有预防牵张性脊髓损伤的作用，若术中体感诱发电位显示脊髓牵张性损伤后，在去除脊柱牵拉力的同时给予丹参治疗，可以减轻脊髓的继发性损伤程度）,9,丹参的药理作用,抗炎作用 体内外实验证明，丹参具有抑制炎症作用。丹参抑制炎症细胞内细胞因子的产生，同时与抑制花生四烯酸的代谢也有关系对神经细胞有保护作用 体内、外实验证明，丹参对大鼠脑微粒体钠钾ATP酶活性有促进作用,10,肉毒素,是厌氧菌梭菌属肉毒杆菌释放的一种外毒素，共有8个血清型 (A、B、C1、C2、D、E、F、G)；各型肉毒素在细胞内的作用机制相似。研究较多的是A、B两种亚型，A型活性强、作用时间长，临床应用以A型为主。,11,作用机制,肉毒素A能抑制神经递质释放 ，包括谷氨酸（Glu）、P物质(SP)等谷氨酸通过外周传入纤维的谷氨酸受体刺激局部伤害性神经元引起疼痛。局部炎症能增加伤害性感觉神经末梢谷氨酸受体的数目。使用外源性的谷氨酸可以激活这些受体，导致老鼠和人体的伤害性行为,12,福尔马林可导致局部谷氨酸释放增多，诱发疼痛。Minglei Cui等对福尔马林诱发的大鼠疼痛模型进行了研究，结果发现用肉毒素-A预处理的大鼠脚爪中谷氨酸量显著降低，不同剂量组的研究显示，肉毒素-A对谷氨酸的抑制作用有剂量依赖性,13,Kim 等发现颈交感神经节注射肉毒素-A可导致瞳孔缩小，这种抑制颈交感神经传导的作用呈现剂量依赖性，随后的病理研究结果显示试验组与对照组神经细胞形态及组织结构改变无统计学意义，只是功能性改变,14,降钙素基因相关肽CGRP）、P物质SP,SP是一种兴奋性神经递质或调质，是C类神经纤维释放的化学信息物质，主要起传导痛觉的作用CGRP是目前已知的在背根节及脊髓后角中的与疼痛信息传递密切相关的神经递质，它参与痛觉信息的传递和调制,15,实验内容,第一部分：测定各组实验动物治疗前后的痛阈值，并比较其治疗前后的变化。（机械缩足反射阈值的测定） 第二部分：测定各组实验动物脊髓、脊髓背角 CGRP 和SP的含量,16,研究目的、预期目标,通过中药丹参注射液、不同剂量的肉毒素、以及丹参注射液与肉毒素相联合对坐骨神经结扎模型（CCI）产生的神经病理性疼痛模型中背根神经节、脊髓以及坐骨神经的影响，为临床应用丹参注射液、肉毒素治疗慢性、顽固性疼痛（如慢性腰腿痛、头痛、三叉神经痛、带状疱疹神经痛、脊髓损伤性疼痛等等）提供依据，进而探讨中药治疗神经病理性疼痛得有效性。目前已证实。,17,路线图,18,实验方法,动物选择及分组： 雄性SD健康成年大鼠120只，体重300320g，随机分为12组，每组8-10只：（1）正常对照组（2）假手术组（3）手术+丹参组（丹参注射液0.1ml/kg）（4）手术+丹参组（丹参注射液0.2ml/kg、）（5）手术+丹参组（丹参注射液0.4ml/kg）（6）手术+生理盐水组 （7）手术+肉毒素组（肉毒素3.5u/kg）（8）手术+肉毒素组（肉毒素7.0u/kg）（9）手术+肉毒素组（肉毒素15u/kg）（10）手术+肉毒素+丹参组 （0.1ml/kg + 15u/kg ）（11）手术+肉毒素+丹参组 （0.4ml/kg+3.5u/kg）（12）手术+肉毒素+丹参组 （0.2ml/kg+7.0u/kg）,19,手术结扎坐骨神经制成坐骨神经痛模型,采用Bennet和Xie于1988 年创建的方法, 6%水合氯醛(300mg/kg, 腹腔注射) 麻醉, 将CCI组大鼠于股骨后暴露右侧坐骨神经, 在接近分叉之前游离出7mm 的神经, 显微镜下用4-0 铬制肠线间隔1mm 结扎4 处(以不影响神经外膜血运为度) 逐层缝合, 术后肌注青霉素8万单位, 每天2次; 假手术组仅暴露坐骨神经干, 不予结扎,20,给药方案,结扎后第10天，按照分组情况分别给实验动物结扎神经处注射丹参注射液、生理盐水、肉毒素。丹参注射液、生理盐水每天注射，连续7天，肉毒素结扎后第10天时一次性给予,21,免疫组化法测定神经根和脊髓SP及CGRP表达,于最后一次给药后1、3、7周对大鼠进行灌注、取材。大鼠在水合氯醛腹腔深度麻醉下，开胸暴露心脏，于心尖处剪开一小口，用大鼠灌胃管插至主动脉，剪开右心耳，用生理盐水200 ml经主动脉灌注，右心耳引流，再用缓冲液配制的4的多聚甲醛200 ml灌注固定。手术切除胸段至骶段脊柱，显微器械小心打开椎板，于L4-6椎间孔分离取出两侧背角神经节，分别放入4多聚甲醛溶液标本瓶和2.5戊二醛溶液标本瓶以备免疫组化和电镜检测。并取出与神经节相对应的胸段脊髓，经中央沟切成两半，分别放入