助溶剂对溶质溶剂间氢键动态的影响14翻译.docx

助溶剂对溶质溶剂间氢键动态的影响超快速2D红外光谱研究摘要：助溶剂显著影响水性环境中生物分子的溶质溶剂交互作用，而且对许多蛋白质和酶的稳定性和活性有着重要影响。早先的实验研究报道了水分子暴露在助溶剂中时的氢键动态，但是，若从溶质的视角去理解这一影响将会提供更多对蛋白稳定性的洞悉。因为羰基群在生物分子中非常丰富，当前的研究致力于利用2D红外光谱和分子动态模拟技术去比较溶质的羰基群在有或无DMSO作为助溶剂的两种水溶液中氢键动力学的不同。红外用来从数量上估计羰基在纯水或DMSO：水=1：1（v、v）的溶液中氢键动态交换的时间尺度。红外结果发现了化学交换进程的波普特征：助溶剂的加入会将氢键交换比率降低五倍。测得纯水和溶液的交换比率分别为7.50 1011 and 1.48 1011 s1。分子动力学模拟预测了纯水比加DMSO的溶液羰基氢键寿命会显著缩短并且提供了交换机制的分子洞悉。助溶剂和溶质分子的结合伴随着大量水分子氢键的断裂。有无DMSO所造成的氢键寿命和交换比率的巨大不同表明了助溶剂参与条件下快速氢键动态的显著改变，这一改变或许在生物分子的稳定性及活性中起着重要作用。1. 介绍：最近几年，助溶剂对生物分子在水性环境中的影响受到广泛关注。在蛋白质水溶液中加入助溶剂会改变生物分子的性能，比如蛋白质稳定性、溶解性、自组装等。助溶剂会扰乱蛋白水溶液中蛋白的构象平衡而选择性地阻止或促进蛋白质的变性。理论研究被用于去理解助溶剂对蛋白质稳定性的影响。溶质与助溶剂的交互作用通常被视为一个交换过程，在这一过程中助溶剂的结合伴随着大部分水分子氢键的断裂。助溶剂对许多酶的活性也有影响。助溶剂可充当冷冻剂，可用于在水溶液中保存干细胞、器官、精子。理解这类行为的基本机制有助于设计想要的蛋白质和酶的性质。由于DMSO在室温下可与水混溶，因此它是一种被广泛应用在水溶液中的助溶剂。DMSO是一种高极性的分子，可以接受氢键，可以扰乱水分子的氢键缔合结构并将自己与蛋白质、核酸、碳水化合物以及离子等物质联系起来。作为一种助溶剂，DMSO在化学、生物学、药物学等领域有着重要意义。DMSO被普遍地用作助溶剂去增加小的有机分子的溶解性，于是便被用作沿着细胞膜分布的药物载体。蛋白质稳定性和酶的活性依赖于溶液中DMSO的浓度而改变。许多诸如振动光谱、中子散射、介电谱等实验方法被用于研究DMSO/水溶液的结构性能。最近利用x射线吸收、发射和散射实验对这一体系中的氢键影响做了研究。理论计算研究也被用于去阐明这一混合物的结构。尽管许多科研都聚焦在不同DMSO浓度下DMSO水溶液中结构改变以及交互作用上，关于DMSO作为助溶剂对水动态的影响至今仍未达成一致。NMR和介电弛豫实验预测了DMSO加入后水旋转运动的显著减慢，而中子散射和拉曼诱导科尔效应光谱实验报道了较之纯水更快的旋转时间。不久前的一个研究中，Fayer和他的同事们利用极化-选择泵浦-探测实验和二维红外光谱研究了在DMSO水溶液中加重水（HOD）稀释时的超速动态变化。他们的实验结果描述了水在多个时间尺度上的结构动态，从局部氢键的超快速波动到完整结构不规则分布的较慢动态。尽管在DMSO溶液中水的氢键动态已被研究，但绝大部分研究都聚焦于从溶剂的视角理解这一动态。DMSO作为一种溶质分子的助溶剂在水中的影响至今未被探索。从溶质的视角去理解这一动态改变将提供对加入助溶剂后蛋白质稳定性变化的一个更加深刻的洞悉。在本篇文献中，我们报告了以乙酸乙酯中羰基为例的羰基-水氢键动态在有或无DMSO加入情况下的不同。在红外和核磁相关分析的基础上，最近发现，乙酸乙酯中酯的羰基在DMSO水溶液中存在于两个不同的环境，而且两者交换的时间尺度远远快于NMR的时间分辨率。2DIR被证实是一种非常强大的可用于研究溶液相中小分子和蛋白质的快速结构波动和交换动态的实验技术。在这一研究中，我们利用2DIR去观察在两种不同体系中（纯水和DMSO水1：1体积比混合）乙酸乙酯羰基的伸缩振动模式超快动态变化。红外结果表明甚至在没有DMSO加入的条件下酯的羰基存在有两种不同的环境并且在约1.3ps的时间尺度上经历着化学交换。这一时间尺度从数量上与所报道的水中氢键形成和断裂的时间尺度相匹配。诸如乙酸乙酯、乙酸甲酯等小分子酯在纯溶剂中的超快速化学交换过程也曾被报道。加入DMSO后，我们的红外结果证实了早先对于化学交换的预测，但是测得的交换时间尺度为约6.8ps，较之纯水要慢很多。这一研究也报告了在纯水或1：1溶液中乙酸乙酯上执行的分子动态模拟。对分子动态轨迹的羰基氢键的分析预测了在各个溶剂化环境中化学交换的存在；在助溶剂加入的情况下，氢键的形成和断裂进程要显著慢于纯水。在有或无DMSO的环境下，由MD模拟所预测的乙酸乙酯羰基氢键的寿命的比可以比得上实验所获得的交换时间尺度。一个详细的MD快照分析提供了一个在助溶剂加入时交换机制的分子水平的照片。由于在蛋白质的骨架及侧链中有着丰富的羰基群，我们当前的研究将会有助于解释复杂生物分子体系的结果。在此所描述的结果也将为助溶剂加入对小分子的溶解动态提供新的视角。2. 实验方案样品：40mM乙酸乙酯重水溶液、1：1（v/v）DMSO/water （用于IR吸收和2DIR实验）。乙酸乙酯、重水和DMSO从Sigma-Aldrich购进而且没有做进一步的纯化。所有的光谱数据均在室温（22度）下收集。线性红外光谱：傅立叶变换红外吸收光谱被记录在分辨率为0.25cm-1的Varian 670-IR光谱仪。对于每个试样来说，大约8微升的样品溶液装在一个有两个被25微米厚四氟乙烯垫片分离的氟化钙窗口的样品池中。2DIR：在经典的二维红外实验中，三个超短的被控制偏振且频率调在乙酸乙酯中羰基伸缩振动频率（约1720cm-1）的红外脉冲打在样品上。二维红外光谱实验方案和数据处理程序之前已有报道。用于实验的红外脉冲是由国产的光参量放大器（OPA）生成的。三个连续的IR脉冲，波矢k1、k2、k3用于诱导样品中振动回声的后续发射。通过与局部振荡器相结合，在相位匹配方向的振动回声的频率和相位分辨率得以测得。LO脉冲以约1ps的时间间隔先于回声信号出现。合并后的脉冲在单色仪平面聚焦，利用64元素碲化镉汞(MCT)红外阵列探测器检测，使这一信号作为检测时间t的函数而被测量。每一个二维红外振动回声数据点都是三个变量的函数：发出的振动回声的频率、第一个脉冲与第二个脉冲之间的时间间隔、第二个和第三个脉冲之间的时间间隔T。单色仪的焦距是190mm，单色仪的光栅沟密度为150lines每毫米。从-3到+3ps以2fs速度扫描。正值与负值分别代表非重相和重相。这里所展示的所有红外光谱收集时均被平行极化，代表着真实区域的吸收光谱。线性红外和二维红外的数值模拟：4. 结果与讨论 线性红外光谱：figure 1 显示的是扣除背景后乙酸乙酯中羰基伸缩振动的傅立叶变换红外光谱（共重水、DMSO、1：1混合物三种环境中）。在水中，出现一个羰基振动频率的宽的不对称的曲线，1703.5处达峰值。而在DMSO中则是一个尖锐单峰，峰值在1732.8。在1：1混合物中，观察到两个峰，相差20。然而，在非质子溶剂DMSO中，低频峰完全消失，只剩一个高频峰。一个之前的研究提到，高频峰在DMSO作为助溶剂和纯DMSO中位置接近，然而低频峰对应羰基与水分子形成氢键的位置并导致最大值红移。然而，在碳谱核磁中乙酸乙酯1：1混合物中羰基碳原子的单峰表明在NMR不可测的时间尺度上存在着氢键交换的动态过程。这鼓舞了我们利用二维红外去理解在DMSO做助溶剂时的快速动态过程。二维红外：figure 2：乙酸乙酯的DMSO/H2O1：1溶液中不同等待时间（0、1、2、3、4ps）下实验吸收和二维红外谱。利用二维红外分别对纯水及1：1DMSO/water溶液中乙酸乙酯羰基的氢键动态做了研究，用于理解助溶剂对羰基氢键动态的影响。Figure2 左边一栏显示的是乙酸乙酯在1：1DMSO/water溶液中不同等待时间（0、1、2、3、4ps）下的实验吸收和二维红外光谱。在二维红外中，红色的峰表示=0 1的能级跃迁，蓝色表示1-2的跃迁。正如在figure1中所看到的那样，二维红外中沿着纵轴可以明显看到在约1708和约1730处有两个明显的转变。在二维红外中，第一个激光脉冲同时标志着有着初始频率的氢键键和或自由状态下的羰基初始结构。T=0时，所有物种均未改变初始结构，因此最终频率与初始频率相同。这就导致了沿着对角线出现了两对细长的斜峰。一对在低频的氢键键合的羰基，一对在高频的自由羰基。在更长的等待时间下，由于溶剂的固有波动，羰基与水分子之间的氢键形成和断裂导致了羰基从自由到氢键键合状态的交换，反之亦然。在二维红外中体现为两对斜峰之间交叉峰的出现，并且随着T的增加，交叉峰的较之斜峰相对大小也逐渐增大。比如，在(, t) (1708,1730 cm1)处的交叉峰在T=4时很明显，而且形状变得规则（矩形）。在T=0时没有出现这一情况。不同T值下所观测到的交叉峰是两种不同结构构型快速化学交换动态的不同光谱特性。羰基与水分子之间氢键的形成和断裂造成了氢键建和或自由状态下羰基两个跃迁状态下交叉峰的出现。为了确定氢键交换过程的动率，利用Kubo-Anderson two-state交换模型对实验获得的二维红外光谱进行模拟。交叉峰的相对大小经常被用于获得化学交换过程的动力参数，但是在这一特殊情境下，由于两种羰基环境频率之差很小，斜峰与交叉峰之间的重叠使各自峰的大小估计变得极度困难。在实验获得的二维红外光谱与模拟二维红外光谱之间进行最小二乘法模拟被用于估计化学交换过程的动率。V=0势能面上测得的交换比率为：4.76 1010 and 1.004 1011 s1 for the forw