生物化学检验中的诊断酶学课件pptConvertor.doc

诊断酶学目的要求：熟悉酶在体内的病生变化机制；掌握酶促反应动力学的基本原理及酶活性测定方法;掌握肝胆疾病的酶学指标应用与评价；第一节 概述临床酶学：指临床实验室应用酶作为多种疾病的诊断、预防、治疗及预后评估的学科。包括基础酶学、诊断酶学、治疗酶学基础酶学：注重酶的动力学研究；诊断酶学：应用酶、酶试剂对疾病进行诊断；治疗酶学：利用酶制剂进行疾病治疗；一、复习酶的概念、结构与功能1.基本概念 酶是活细胞的产物，是生物催化剂；生物催化剂的特性：（1）高度不稳定性； （2）催化效率极高；（3）高度特异性； （4）催化作用的可调节性；2.结构与功能（1）酶的化学组成 单纯酶 结合酶 酶蛋白 + 辅助因子全酶 辅基 结合紧密 辅酶 结合疏松（2）酶的活性中心指酶分子表面的能与底物结合并起催化反应的特定区域，该区域由酶的必需基团所组成。酶的活性中心被占据或构象发生改变均可导致酶的催化效率下降或消失。二、血浆（清）酶分类1.血浆特异酶 在血浆中发挥作用，其降低表示合成该酶的组织受损。2.非血浆特异酶 在血浆中含量较低且无任何功能（1）外分泌酶 来源于外分泌腺，其浓度与分泌的腺体功能有关（2）代谢酶 存在于各种组织细胞，参与物质代谢；血清中大量出现时提示细胞受损；代谢酶分为： 一般代谢酶 器官特异性酶四、血清酶变化的病生机制过多 细胞内 酶生成 过少 变异 K2 K1 K3 组织间隙 血管内 K4 K8 抑制 抑制 酶 激活 酶 激活 变化 变化 K7 K5 K6 图示说明： 不同组织或器官中的酶进入血中的途径不同；不同的酶其清除方式不同；控制血清酶水平的因素：1.酶在细胞内的合成速度2.酶从细胞释入血清的速度取决于三个方面： 细胞内外酶浓度差；酶蛋白分子量的大小；酶在细胞内的定位及存在形式；3.酶在细胞外间隙的分布和运送酶从胞内进入血液的途径：（1）直接进入血液（2）部分直接入血，部分进入组织间隙（3）经淋巴系统入血4.酶从血中清除的速度可用酶的半衰期表示*血清酶从血清中消失的速率因人不同，因酶而异，随疾病过程的不同时间而变化。5.其它注意激活剂或抑制剂对酶活性的影响五、其它影响血清酶的因素1. 生理因素的影响 性别、年龄、进食、运动、妊娠等2.测定方法的影响 方法的不同（速率法、终点法）测定条件的不同单位的差异3.标本的影响（1）最好用血清 （2）溶血的影响（3）尽快、及时分离 （4）样品的存放4.其它因素对酶活性测定的影响（1）温度的影响 （2）抑制剂的影响（3）样品中酶浓度的影响 （4）反应体系中其它物质的影响其它酶和物质；工具酶的污染；非酶反应；容器的污染等。第二节 酶活性测定的基本知识一、酶活性的概念 酶活性即酶促反应速度（v）：指在规定的条件下，单位时间（t）内底物（s）的减少量或产物（p）的增加量。 v - ds / dt v dp / dt 注意：强调单位时间的变化量二、酶促反应进程 时间t1.四个时期典型酶促反应历程：预孵育期-延滞期-线性期-非线性期（1）预孵育期：未开始反应之前于一定温度下孵育的时期（2）延滞期（a）：反应开始但还未出现明显变化的时期（3）线性期（b）：底物或产物的变化与时间成直线关系的时期（4）非线性期（c）：反应速度持续下降，底物或产物的变化与时间不成直线关系的时期2.酶促反应初速度通过酶活性测定酶的含量，是一种间接的测定方法；利用酶浓度E与酶促反应速度成正比；酶促反应速度指初速度；三、酶促反应底物动力学中间产物学说 k1 k2E + S ES E + P k-1研究影响酶促反应速度的因素应注意：（1）反应体系其它因素不变，只单独变动研究对象（2 ）所用速度为初速度1.底物浓度对酶促反应速度的影响 Km S（1）一级反应 指反应速度与底物浓度成正比 Vk S（2）零级反应 指反应速度不受底物浓度影响，即与底物浓度无关时的反应 Vk Sk酶活性测定应在零级反应进行，此时的反应速度才能代表酶浓度。2.其它因素对酶促反应速度的影响（1）酶浓度的影响（2）pH的影响（3）温度的影响（4）激动剂、抑制剂的影响3.米氏方程： Vm SV Km + S当酶浓度不同时，可得到不同的Vm，当酶浓度固定下来时，则Vm为一常数。（1）米氏方程的讨论当S Km时 v=Vm，为零级反应当S Km时 v= Vm / KmS，为一级反应当v=1/2Vm时 Km=S（2）Km的物理意义为速度常数的复合函数，代表三个方向；反映酶与底物的亲和力；为酶的特征性物理常数（3）Km的应用 选择合适的底物浓度 计算v能达到Vm的百分率 确定酶的天然底物 确定工具酶用量及鉴别酶（4）Vm的应用 酶浓度一旦确定，Vm即为一常数； 它代表酶完全被底物分子饱和时的反应速度；4. Km、Vm的测定（1）双倒数作图法 对米氏方程两边取倒数； 1/v为纵坐标，1/ s为横坐标作图； 注意：横、纵坐标的交点 求出其Km和Vm； 注意：Km、Vm的单位（2）直接线性作图法 底物浓度标在X轴的负半轴； 底物浓度与对应的反应速度连线所得交点坐标为（Km、Vm）; 交点太多时可取中位数；以ALP磷酸苯二钠法为例介绍Km、Vm的测定（双倒数作图法和直接线性作图法）第三节 酶活性测定方法及酶学分析类型概述酶浓度的测定方法：绝对定量法 依据酶的本质是蛋白质相对定量法 依据酶的催化活性及酶促反应速度酶测定技术：分光光度法、荧光法、测压法、旋光法、放射化学法、电化学法等一、酶活性测定方法酶活性测定法是间接（或相对）测定酶浓度的一种方法，它是建立在酶浓度E与反应产物P或底物S的变化成正比的基础之上，且不能受其它因素的影响，才能根据反应速度来表示酶浓度的大小。测定方法： 固定时间法和连续监测法1.固定时间法又称定时法、终点法、两点法（1）定义 将酶液在适当的缓冲系统中与底物保温一段时间后，终止酶促反应，通过适当的物理化学方法测定其中产物的生成量或底物的消耗量。（2）特点：必须保证酶与底物在所选定的温度下作用时间准确必须终止反应后，才能测定体系中产物或底物的变化量（3）优缺点优点：对仪器设备要求不高、试剂成本较低、适用于基层及大批量测定。缺点：不能了解酶促反应历程，无法保证测定是在线性期内进行；测定时间长，高活性时偏离较大。2.连续监测法又称速率法（1）定义 在酶促反应的最适条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法来连续观察和记录不同反应时间内底物或产物的变化，计算出酶促反应初速度。（2）特点：不需终止酶促反应可动态观察整个反应历程，从而避开延滞期和非线性期反应时间短，测定的是初速度（3）优缺点 在线性期内测定，结果准确，但对仪器设备要求较高（4）满足速率法测定的要求要求具有能够精确控制温度等反应条件；要求仪器具有恒温装置及自动监测功能；要求反应体系中底物或产物能够直接测定；3.分类 直接法和间接法（1）直接法 直接测定反应体系中产物的增加量或底物的消耗量。 E 底物 产物 （无色或无吸收） （有色或有吸收）如：LDH测定（2）间接法 指在反应体系中加入某些试剂而不改变（或不影响）所测酶的活性，并可以产生被直接测定的物质的方法称为间接法。二、酶活性单位的表示及计算1.酶活性单位 指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。（1）惯用单位 如：卡门氏单位、 金氏单位、 苏氏单位（2）国际单位指在规定的条件下，每分钟催化1umol/L的底物发生转化的酶量。用U/L表示（3）Katal单位指在规定的条件下，每秒钟催化1mol/L的底物发生转化的酶量。用nkat/L表示国际单位与Katal单位的换算：1U/L 16.67 nkat/L2.酶活性单位的计算 计算公式：U / L = DAmin ( V106/evL )V 反应体系体积（ml） e 摩尔吸光系数（L.cm-1.mol-1）v 样品量（ml） L 比色杯光径（cm）Amin 每分钟吸光度的变化 106 将mol换算成mmol 公式中：是某一物质的特征性常数，但会受到外界条件的影响； V106/evL 为一常数，可用F表示因此：U / L = DAmin F三、酶偶联测定法1.偶联反应原理 在反应体系中加入酶试剂（如辅助酶、指示酶等）使其与待测酶偶联起来，称为酶偶联法。酶试剂-工具酶：指作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶称为工具酶。酶偶联反应的模式一： Ex Ei A B PEx：待测酶； Ei：指示酶例如 ： AST测定 AST-酮戊二酸 + 天门冬氨酸 谷氨酸 + 草酰乙酸 MDH草酰乙酸 + NADH + H+ 苹果酸 + NAD+酶偶联反应的模式二： Ex Ea Ei A B C PEx：待测酶； Ea：辅助酶 ； Ei：指示酶例如：CK测定 CK磷酸肌酸 + ADP 肌酸 + ATP HKATP + 葡萄糖 ADP + 6-磷酸葡萄糖 G-6-PD6-磷酸葡萄糖 + NADP+ 6-磷酸葡萄糖酸 + NADPH + H+2.对偶联反应的要求偶联反应是利用指示酶的反应来间接推算出待测酶的活性，因此有明显的延滞期。要求：（1）待测酶的反应为限速反应 （2）指示酶的反应必须是一级反应（3）指示酶反应条件与待测酶一致（4）反应必须避开延滞期3.工具酶与指示反应（1）定义 指作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶。（2）要求 容易获取、价格低廉 具有一定的比活性（3）指示反应：脱氢酶系统 NAD(P)H 340nm有吸收 NAD(P)+ 340nm无吸收氧化酶系统 Trinder反应，主要用于测定代谢物第四节 同工酶测定一、概念1.定义 指同一种属中由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂交体，其理化性质及生物学性质不同但具有相同催化功能的一组酶，称为同工酶。同工酶在理化性质上的差异：对底物的亲和性、特异性不同； 对抑制物可出现不同的反应；对热的耐受性不同；同工酶在结构上的差异：酶蛋白的氨基酸组成或排列顺序2.应用（1）检测同工酶活性比只测总酶活性更具有脏器特异性和更高的灵敏度；如：LDH及LDH1和LDH5测定（2）检测同工酶能早期诊断疾病；如：CK与CK-MB测定3.同工酶的分析方法（1）电泳法常用，以偶氮染料和四唑盐应用较多；注意巨分子酶的影响；（2）免疫化学法常用免疫抑制法和免疫沉淀法免疫抑制法：利用同工酶的一种亚型与相应抗体结合后活性受抑，通过测定加或不加抗体前后样品中酶活性的改变进行计算。如： CK-MB测定采用足量CK-MM抗血清抑制其活性免疫沉淀法：利用抗原抗体形成复合物而沉淀，测定上清液中其它亚型的活性，利用总酶活性上清液酶活性被测同工酶活性。 沉淀形成过程缓慢，用时较长。 其它免疫学法测定酶蛋白： 成本较高（3）动力学分析法 利用不同的同工酶对底物的亲和性不同，据Km值的不同进行分析；热失活分析；pH分析；二、以LDH同工酶为例介绍1.基本特征：乳酸脱氢酶（LDH）：催化丙酮酸和乳酸之间的还原与氧化反应；LDH是一组含Zn2+的酶类；由H亚基（心型）和M亚基（肌型）组成四聚体，形成五种结构不同的同工酶，分别是： H4 H3M H2M2 HM3 M4LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5H亚基：12号染色体的a基因编码；含酸性氨基酸较多；耐热、65C稳定；对乳酸的亲和力强；易受草酸的抑制；M亚基：11号染色体的b基因编码；含碱性氨基酸较多；耐热性较差，57C失活；对丙酮酸的亲和力较强；易受草酸和尿素的抑制；2.主要分布：以LDH1为主，主要存在于心肌、红细胞；以LDH5为主，主要存在于横纹肌和肝脏；以LDH3为主，主要存在于脾、肺等组织；LDH为冷变性酶（主要是LDH4、LDH5）需室温保存。3.临床应用（1）诊断心肌损伤（2）诊断肝脏疾病 LDH总酶 LDH1 LDH5 疾病 N 心肌损伤 N 肝脏疾病第五节 体液中常见酶的测定一、肝酶谱1.ALT （1）ALT基本特征 磷酸吡哆醛作为辅基与酶蛋白构成全酶；ALT分布广泛；肝细胞中的ALT主要存在于胞质；（2）临床应用 ALT我国测定次数最多的酶； 肝损伤的灵敏指标（检测阳性率可达80100）； 急性肝炎时，其活性的高低与病情轻重相平行； ALT半衰期较长，为急性肝炎恢复期最后降至正常的酶类； 中毒性、酒精性肝炎时ALT升高；慢性活动性肝炎时也呈中度升高；注意：ALT分布广泛，ALT升高不一定存在肝脏疾病，应对其进行具体分析；“酶胆分离”常作为肝坏死的先兆；ALT长期升高但肝脏病理检查无病理改变，预后较好；（3）测定方法 常用：赖氏法速率法2.AST（1）AST基本特征 磷酸吡哆醛作为辅基与酶蛋白构成全酶；肝细胞中的AST70存在于线粒体中；AST的同工酶分为： ASTs-存在于胞质 ASTm-存在于线粒体（2）临床应用 作为心肌酶谱中的一个指标；对AMI的诊断无特别意义，主要用于预后的判断。 AST活性的大小同并发心力衰竭的发生率和死亡率成正比。 作为肝细胞损伤的一个指标。 利用m-AST/总AST比值了解病情轻重： 正常人m-AST/总AST1.62 0.9 m-AST/总AST较低-病情较轻 m-AST/总AST升高-病情加重（肝坏死） 利用AST/ALT比值判断急性肝炎的转归： 正常人AST/ALT1.15 急性肝炎患者AST/ALT 1，若比值逐渐下降，病情好转（AST逐渐降低，ALT半衰期为AST的三倍）； 急性病程中的AST/ALT比值明显升高，预示可发生暴发性肝炎； 利用AST/ALT比值判断急、慢性肝炎3.ALP （1）基本特征 ALP是一组含Zn2+的糖蛋白； 该酶对底物的专一性较差； 该酶活性需要Mg2+ 、 Mn2+的激活，测定血浆ALP时只能选择肝素作为抗凝剂； ALP在体内分布较为广泛 在肝脏中的ALP主要分布于肝细胞的血窦侧和毛细胆管侧的微绒毛上，经胆汁排入小肠。 ALP同工酶分为：小肠ALP、胎盘ALP、组织非特异性ALP（包括存在于骨、肝、肾的ALP）（2）临床应用 骨骼损伤的检测 、 黄疸的鉴别无黄疸的肝脏疾病病人，ALP升高明显异常，应考虑有无肝的占位性病变4.GGT（1）基本特征 GGT为含有巯基（-SH）的糖蛋白；GGT分布较为广泛，血中的GGT主要来自肝胆系统；肝脏中的GGT分布在肝细胞的毛细血胆管侧和整个胆管系统；大部分与细胞膜结构结合，为疏水性，小部分存在于胞浆；（2）临床应用肝实质性疾病：肝炎、脂肪肝、肝硬化GGT中度升高；可用于判断肝病是否处于活动期：慢活肝 GGT ，非活动期GGT 正常胆道疾病：胆石症、胆管炎、肝外梗阻时GGT 用于鉴别诊断： ALP GGT 胆道疾患ALP - GGT 肝脏疾患ALP GGT - 骨骼疾患、生长期、妊娠期GGT属于肝诱导酶第六节 心肌损伤的生物化学检验一、概述 1.基本概念 缺血性冠状动脉疾病主要指由于冠状动脉的粥样硬化使得血管腔阻塞，导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏疾病，简称冠心病或缺血性心脏病。包括心绞痛和急性心肌梗死。（1）心绞痛指急性、短暂性心肌缺血缺氧所引起的临床综合症。由冠状动脉供血的绝对或相对不足而造成。稳定性心绞痛（劳累型心绞痛） 不稳定性心绞痛（变异型心绞痛）（2）急性心肌梗死（AMI）AMI：指在冠状动脉粥样硬化的基础上，出现一支或多支冠状动脉闭塞，使血流中断而使相应的心肌出现持久缺血缺氧所致的心肌大面积坏死。a) 部分病人可出现AMI的先兆：b) 严重的心绞痛发作；程度、性质改变；出现消化道症状；伴有心功能不全；有心电图的改变等。c) 部分病人无先兆d) 部分病人为无痛性心梗AMI对病人的损害： 三大合并症：心源性休克；心力衰竭；心律失常；五大并发症：乳头肌功能失调或断裂；室壁瘤；栓塞；心脏破裂；心梗后综合症；2.AMI的诊断依据WHO（1979年）：（1）临床表现和症状（典型的持续胸痛）（2）ECG的特异改变（Q波、S-T段抬高）（3）血清中有关酶浓度出现升高降低的动态过程出现两种以上的改变即可诊断AMI。*注意各点的不足之处欧洲和美国心脏病学会的诊断标准（2000年）：心肌肌钙蛋白（cTn）升高随后缓慢降低或CK-MB快速升高后降低，并伴有下述表现之一者可诊断为AMI。（1）缺血症状 （2）ECG出现病理性Q波（3）ECG呈缺血改变（S-T段抬高或降低）（4）冠状动脉检查异常3.理想的心肌损伤标志物从临床应用角度希望的心脏标志物：（1）主要或仅存于心肌组织而非心肌组织不存在（高特异性）（2）心肌损伤后能快速释放入血，即能检测早期损伤（高敏感度）（3）在血中能维持较长时间的高浓度，即检测“窗口期”较长（4）能被快速分析，可估计梗死范围大小判断预后（5）能评估溶栓效果二、酶学诊断1.血清酶在诊断心梗中的应用用于诊断心梗的主要酶包括：CK及CK-MB、AST、HBDH、LDH（1）AMI时血清中心脏酶活性变化机制心肌酶的释放速度缺血导致能量代谢障碍，离子泵功能障碍，引起细胞肿胀，膜孔隙增大，细胞内酶溢出。细胞内外酶浓度差、酶蛋白分子量、酶在细胞内的定位形式心肌酶在细胞间隙的分布和运送两种途径：直接入血和经淋巴系统回流入血血中酶的清除酶 半衰期 酶 半衰期LDH 113h CK 15hCK-MB 12h酶清除的机制 肾排出 网状内皮系统 血管内的失活或分解（2）AMI时心肌酶的变化时相特点： 不同的酶出现升高的时间不同； 不同的酶活性升高的幅度不同； 不同的酶升高后在血中持续的时间不同；2.CK及其同工酶的临床应用（1）基本特征 Mg2+是CK的必需激活剂； 酶蛋白结构中含有二硫键，需加入巯基保护剂； CK是由M亚基和B亚基组成的二聚体，形成不同的亚型，亚型的分布具有器官特异性； CK-MM（肌型） CK-MB（心型） CK-MB心肌含量较高，是骨骼肌中含量的5倍；但骨骼肌的总CK活性是心肌的5倍； CK-BB（脑型）（2）CK测定的临床应用肌萎缩病因的鉴别：各类进行性肌萎缩时CK ，神经因素引起的肌萎缩CK活性正常AMI的早期诊断：心肌细胞含量多；存在于胞质且分子量较小；肝、肾、血细胞中含量极微；注意： CK测定的局限性 发生心梗后不同时间检测的意义（AMI发病8h，CK不升高不能轻易排除AMI的诊断；发病24hCK正常可排除诊断；48h内多次测定不出现典型的升高降低过程时，应怀疑AMI的诊断） 作为早期指标（3）CK-MB测定的临床应用对AMI的诊断具有较高的特异性和灵敏度： 假阴性 灵敏度 假阳性 特异性心电图 34 66 0 100CK 2 98 15 85CK-MB 0 100 1 99LD1/LD2 10 90 5 95 CK-MB为AMI诊断的早期指标： 开始升高的时间先于CK；升高幅度可达正常上限的20倍；24h达高峰，48h后消失；曾经作为诊断AMI的金标准 CK-MB升高回到正常后又再度升高，说明有新的梗死发生； 测定的局限性检测意义： 阻塞 时间较长A硬化 脱落 脱落处 血小板 血栓 激活纤溶斑块 溃疡 聚集 系统 再通溶栓治疗的首剂药物应在心梗发生的6小时内进行。发生AMI后的46小时是酶的延滞期。小结CK的优点 ：1 ) 快速、经济； 2）可大致判断梗死范围；3）测定心肌的再梗死； 4）用于判断再灌注。不足之处： 1）特异性较差； 2）发病6h以前和36h以后敏感性较低；3）对微小心肌损伤不敏感。临床倾向于用CK-MB替代CK3.LDH及其同工酶的临床应用（1）基本特征 LDH由H亚基（心型）和M亚基（肌型）组成四聚体，形成五种结构不同的同工酶。LDH1 主要在心肌 LDH5 主要在肝脏 （2）临床应用1）诊断AMI的价值： 亚急性心梗 判断预后 无法评估溶栓疗效 -羟丁酸脱氢酶（HBDH）的应用 HBDH是指用酮丁酸取代丙酮酸作为底物时测得的LDH活性； HBDH活性相当于LDH1和LDH2； 诊断AMI时HBDH的特异性高于LDH总活性，但不及LDH1同工酶。4.AST 作为心肌酶谱中的一个指标；对AMI的诊断无特别意义，主要用于预后的判断。5.AST、LDH、CK特异性比较（1）AST含量最多，存在部位广泛，诊断特异性较差；（2）LDH分子量较大，AMI时出现升高迟于其它酶，但半衰期较长，可用于亚急性AMI诊断；LDH1或HBDH活性测定可提高LDH的特异性；（3）CK在骨骼肌和心肌细胞中含量较高，其它疾病很少升高；AMI时CK阳性率与心电图异常相近；CK分子量小，且存在于胞浆，AMI时入血较早，半衰期较短，AMI后CK急剧升高并很快恢复正常，不能用于亚急性AMI的诊断。三、蛋白类标志物检测心肌酶存在的不足之处： 酶活性升高出现较晚：最早出现升高的CK在发病后38小时才开始升高，即在6小时内血清酶正常不能排除AMI的诊断。 持续时间短 特异性较差酶的存在部位广泛1.肌红蛋白（Mb）（1）基本特点： Mb广泛存在于骨骼肌、心肌、动脉平滑肌，占肌肉中所有蛋白的2；Mb分子量小，仅为17.8KD，位于胞质；Mb在血中的半衰期较短（约15min），由肾脏排出，正常人血清中含量甚微；（2）检测意义 Mb是AMI血清中最早出现的生化标志物AMI发生后2hMb可升高，69小时达高峰，2436h恢复正常，为最早可测的标志物；Mb的阴性预测值可达100；胸痛发作212hMb为阴性时，可排除AMI诊断；检测窗口期太短，AMI发作16h后测定Mb易出现假阴性；利用CA的检测可区分AMI与急性骨骼肌损伤；应用Mb诊断AMI时应结合临床症状和病史，排除其它因素后才能确定诊断。2.肌钙蛋白（Tn）（1）分类分型Tn：横纹肌收缩的重要调节蛋白，由三个亚基组成，分别是： TnC TnI TnTTnC： Mr18000，为肌钙蛋白Ca2+的结合亚基，在骨骼肌和心肌中是相同的。TnI： Mr21000，肌动蛋白的抑制亚基，分为三种亚型：快骨骼肌亚型、慢骨骼肌亚型、 心肌亚型（cTnI）占46.2心肌亚型中的41.1的AA序列与快骨骼肌和慢骨骼肌亚型同源。TnT：Mr37000，是收缩蛋白中调节蛋白部分，其分型与TnI相同。心