四章 酶

第四章 酶,第一节 酶的基本性质,一、酶是生物催化剂19世纪50年代，法国微生物学家巴斯德在研究酵母的酒精发酵时，认为酵母能将糖转变成酒精是酵母细胞内的生命物质促成的。后来用酵母细胞提取液也能同样促进酒精的生成，这表明，细胞产生的活性物质是促进酒精生成的原因。1978年，Kuhne提出了酶这个名词。1926年，J.Sumner第一次报道了从刀豆中分离并结晶了一种能催化尿素水解的酶尿酶。,二、酶加快细胞内的化学反应速率,按照能量学的观点，一个化学反应并不是从反应物直接向产物生成的方向进行的。反应的发生，即产物的生成取决于过渡态或转换态的能量状况。只有当反应物在空间定向上有利于反应以及反应物达到转换态所需要的能量时，反应才能发生。越能有效地达到转换态，反应的速率就越大。反应物从基态转变成转换态的自由能差值称为活化能（G）。根据转换态的理论，一种催化剂的作用在于以某种途径降低反应的活化能而增高化学反应的速率。因此，在催化剂存在的情况下，转换态能比较有效地达到，从而增高反应的速率，典型的酶促反应速率比无催化剂存在的反应要高出1061012倍，比非生物催化剂存在下的反应也高出几个数量级。,图 41 催化剂对葡萄糖氧化反应转换态的影响,三、酶不能改变化学反应的平衡,催化剂的功能是增高反应的速率，而不会改变反应的平衡。产物基态的自由能比反应物所具有的自由能低，因此对于该反应来说，化学反应的标准自由能变化（G）是一个负值，平衡有利于产物。该平衡不受任何催化剂的影响。有利的平衡并不意味着反应物转变产物是快速的。只有达到转换态所需要的能量时，反应才能发生。酶的存在，像其他催化剂一样，只能降低达到转换态所需要的能量而不改变反应的平衡，它唯一的作用是加速反应物和产物的相互转化。在反应中，酶不会被消耗，平衡点不会改变，但达到平衡的速率则要快得多。,四、酶的催化反应具有专一性,酶对所选择的底物具有不同程度的选择性。某一种酶往往只能对某一类物质起反应，或者只对某一种 物质起催化反应。一般无机催化剂对它们所作用的底物没有这种严格的选择性。,五、酶的组成,（一）酶是蛋白质除某些具有催化活性的RNA外，所有的酶都是蛋白质，或者以蛋白质为主要成分。酶像其他蛋白质外，都是大分子，具有天然蛋白质所具有的性质。酶的催化活性取决于它们完整的天然蛋白质构象。如果一种酶变性或者解离成亚基，其催化活性就会丧失。如果一种酶降解成氨基酸，它的催化活性也会破坏。蛋白质的一级、二级、三级或四级结构的完整是其催化活性所必需的。,（二）酶的组成有些酶的催化活性只需要特定部位的氨基酸残基，不需要其他化学基团；另一些酶除需要酶蛋白本身外，还需要其他化学组分（辅因子）。辅因子可以是无机离子，也可以是比较复杂的辅酶。同酶蛋白共价结合的辅酶或金属离子叫做辅基。一个完整的、具有催化活性的酶与它的辅基或辅酶一起称为全酶，蛋白质部分叫做脱辅酶或脱辅蛋白质。酶蛋白和辅酶之间的摩尔比例为1:1。当辅酶不足时，酶活性也不足。但是辅酶超过这个比例时，酶活性也不会提高。每一种需要辅酶的酶蛋白与辅酶的结合是专一性的。在全酶的催化反应中，酶蛋白和辅因子所起的作用是不相同的。,酶的化学本质酶的化学本质除有催化活性的RNA之外几乎都是蛋白质。主要依据：酶经酸碱水解后的最终产物是氨基酸，酶能被蛋白质水解酶水解而失活；酶是具有空间结构的生物大分子；酶是两性电解质，在不同pH下呈现不同的离子状态，在电场中向某一电极泳动，各自具有特定的等电点；酶和蛋白质一样，具有不能通过半透膜等胶体性质；酶也有蛋白质所具有的化学呈色反应。,表41 某些含或需金属离子作为辅因子的酶,表42 某些作为特殊原子或基团瞬间载体的辅酶,（三）酶的活性部位虽然酶分子在催化反应中需要有完整的结构，但是并不是整个酶蛋白分子都直接参与反应，直接参与反应的只是酶蛋白分子中的一小部分。这一小部分称为酶的活性中心，或活性部位。酶在进行催化反应时，首先同被作用的底物（即反应物）结合，形成一种复合物，然后中间物转变成产物并释放出酶。酶的活性部位是指酶分子上直接与底物结合并与催化作用有关的部位，是由酶分子上某些氨基酸残基共同构成的。这些氨基酸残基在酶蛋白的一级结构上可能相距较远，但在空间结构上却是十分邻近的。天然而完整的酶蛋白空间结构为酶蛋白表现出催化活性提供了结构基础。酶的活性部位相对地可分为两部分，即参与同底物结合的结合部位和直接进行催化的催化部位。两者都是酶活性所必需的。前者决定酶促反应的专一性，后者决定酶的催化效率。,六、某些RNA具有催化活性,长期以来，人们都认为所有的酶都是蛋白质。但是近20年来，越来越多的例子表明某些RNA分子也是生物催化剂。这些具有催化活性的RNA，叫做ribozyme。酶活性RNA符合酶学关于催化剂的标准，它们具有底物专一性，能提高反应速率，反应前后未发生变化。例如，RNase P是一种与tRNA前体加工成tRNA反应有关的酶。在细胞内，该酶活性包括RNA组分和蛋白质亚基。RNA作为催化剂最重要的例子可能是在蛋白质合成中。H.F.Noller及其同事发现蛋白质合成时，肽键的形成很可能是50 S核糖体亚基催化的。催化这一反应的酶叫做肽基转移酶。,酶活性RNA的一些催化特性加深了对这类生物催化剂的生物学作用的认识，但是，它们并不挑战蛋白质所达到的效率。 酶活性RNA并不满足体内催化的标准，因为它们在体内的分子事件中只作用一次，例如自我剪接； 酶活性RNA在体内和体外所能达到的催化速率由于蛋白质组分的参与有重大的促进。 然而，RNA能催化某些酶反应的事实对这样一种观点是一种实验上的支持，即在DNA和蛋白质进化之前，原是世界由RNA分子所支配。,七、催化抗体抗体酶,抗体是免疫球蛋白。催化抗体又叫做抗体酶。像其他抗体一样，抗体酶也是生物对抗原的某种外源分子作出应答的一种产物，只是这种抗原分子被有目的地改造成某种反应地转换态中间物。推理是：一种能专一同某反应的转换态中间物结合的蛋白质，必定能启动正常反应物进入到活泼的转换态构象。因此，一种抗体酶便能促使它的底物形成转换态构象，从而加速这一反应。常规酶最显著的催化效力是因为对所催化的反应转换态中间物有很高的亲和力，因而抗体酶同它的专一性底物（抗原）必定有很高亲和力。,1、酶易失活凡能使生物大分子变性的因素，如高温、强碱、强酸、重金属盐等都能使酶失去活性，因而酶所催化的反应往往都是在比较温和的常温、常压和接近中性酸碱条件下进行。,酶作为生物催化剂的特点,2、酶具有很高的催化活性,3、酶具有高度的专一性,高度专一性：酶对催化的反应和反应物有严格的选择性。被作用的反应物，通常称为底物。酶往往只能催化一种或一类反应，作用于一种或一类物质。而一般催化剂没有这样严格的选择性。,3、酶活性受到调节和控制,1、调节酶的浓度（1）诱导或抑制酶的合成；（2）调节酶的降解。2、通过激素调节酶活性激素通过与细胞膜或细胞内受体相结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性。,3、反馈抑制调节酶活性反馈抑制：许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的，催化此物质生成的第一步的酶，往往被它们终端产物抑制。4、抑制剂和激活剂对酶活性的调节酶受大分子抑制剂或小分子物质抑制，从而影响酶的活性。5、其他调节方式通过别构调控、酶原的激活、酶的可逆共价修饰和同工酶来调节酶活性。,一、酶的命名(1)习惯命名法: 1、根据其催化底物来命名； 2、根据所催化反应的性质来命名； 3、结合上述两个原则来命名， 4、有时在这些命名基础上加上酶的来源或其 它特点。,第二节 酶的命名与分类,(2)国际系统命名法系统命名首先明确标出酶的所有底物及催化反应的性质，并用“:”符号把底物分开。系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。例如：习惯名称:乙醇脱氢酶系统名称:乙醇：NAD+脱氢酶这里的NAD+既是该酶的辅酶，又作为该酶催化反应的电子受体（即作为另一种底物）。不管酶催化正反应或者逆反应，一般都用同一名称。如果催化的反应包含两种变化，则尽可能用一种变化来表示，另一种功能附后。 例如：谷氨酸脱氢酶的系统名称是谷氨酸： NAD+脱氢酶（脱氨）。,国际生化联合会根据系统命名的准则，将所有已被研究的酶，根据它们催化反应的性质分为六大类：氧化还原酶、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接（或合成）酶类。,二、酶的分类,氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、过氧化物酶（peroxidases）、加氧酶（oxygenases）或还原酶（reductases）如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,(1) 氧化-还原酶 Oxidoreductase,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,(2) 转移酶 Transferase,水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,(3) 水解酶 hydrolase,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。,(4) 裂合酶 Lyase,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。,(5) 异构酶 Isomerase,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,(6)合成酶 Ligase or Synthetase,表 43 酶的分类举例,在每一大类中都有若干亚类，每一亚类再分为若干亚亚类，每一个亚亚类包括若干种具体的酶。每一种酶在国际系统分类中的位置用特定的四个数字组成的编号表示。例如： D葡萄糖ATP D葡萄糖6磷酸ADP催化该反应的酶是葡萄糖：ATP磷酸基转移酶，它催化ATP的末端磷酸基转移到葡萄糖C6位的醇羟基上。该酶的系统分类号是EC 2.7.1.1。这里EC代表国际酶学委员会；第一个数字2是指分类名称（转移酶）；第二个数字7代表亚类（转移磷酸基的酶）；第三个数字表示亚亚类；第四个数字一般只表示某个具体的酶，即该酶在亚亚类中的位置。,酶动力学研究的是酶催化的速率，应用动力学性质描述： 1、酶作为催化剂的生物学作用； 2、酶是怎样完成它们所催化的反应。生物化学最重要的成就之一是酶的动力学研究为酶的立体专一性提供了解释。,第三节 酶反应动力学,一、化学反应动力学,（一）化学反应级数与速率方程动力学实验就是测定单位时间内产物生成量或反应物减少量与发生反应的实验条件之间的关系。对于S P的非酶促异构化反应，中间可能要经过几个反应步骤才能完成。假定这个反应是自发的，基本上是不可逆的，那么该反应的速率v可以用单位时间t内产物的生成量或反应物的减少量来表示：,这里k是速率常数；速率常数表示的是一个反应的速率或效率。反应速率对S作图是一条随底物浓度线性增高的直线。一个反应的总动力学级数是速率方程的指数之和。方程是一级反应的速率方程。在一级反应中只有一种组分起反应。一级反应的速率常数是以时间单位的倒数表示的，通常用秒的倒数（s-1）。如果某个一级反应的k为0.03s-1，可以理解为约3的反应物（S）将在1s内转变成产物P；如果某一反应的k为2 000 s-1，那么只需要千分之几秒反应即可完成。,对于复杂的反应S1+S2 P1+P2，其反应速率由两种底物的浓度决定。如果两种底物以相同的浓度存在，速率方程是： v=-dS1/dt= -dS2/dt=k S1 S2该反应是S1的一级反应和S2的一级反应。由于指数之和是2，因此总反应是二级反应，也是双分子反应。二级反应的速率常数的单位是mol-1.L.s-1。如果反应是2S P，其速率方程为： v=kS2该二级反应的速率与S浓度的平方成正比。,当一个反应的总的反应分子数大于2，那么反应几乎总是采取单分子或双分子的基本步骤，整个速率服从简单的一级或二级反应速率准则。当一种反应物的浓度很高时，大大超过另一种反应物的起始浓度时，那么该反应物在反应中可以从速率方程中排除。于是该反应变成了一种人为的或者拟一级反应，此时速率方程可表示为： v=kS11S20=kS1 这里k=kS20, k是拟一级速率常数。,（二）活化能与速率常数的关系,任何一个化学反应的速率都是与反应物的浓度成正比的。如果反应物进入活化态所需要的活化能（G）越高，反应的速率就越慢。化学反应的速率常数k与活化能之间的关系根据转换态理论可由阿伦尼乌斯方程表示： k=Ae- G/RT 或 1/k=(1/A)e G/RT这里的A是一特定反应的系数，不是指反应物。从上边的方程式可以看出，活化能降低，反应速率增加，即是说，k是与 e- G/RT 成反比的。,化学反应的速率可以通过以下两种方式增加：升高温度。 升高反应的温度将会增加反应物分子的平均自由能，有可能使某些反应物进入到转换态。许多化学反应温度每升高10，反应速率可以提高1倍。加入催化剂 化学反应速率可因催化剂的加入而加快，因为催化剂的加入可以降低反应物分子转化态所需要的能量。,二、酶促反应动力学,由于酶是生物催化剂，它们的最基本特性就是加快生物化学反应的速率。因此，酶促反应的速率以及它们的催化效率都是都是可以定量的，这就是酶促反应动力学研究的基本内容。酶动力学研究始于1902年，当时，A.Brown用酵母呋喃果糖糖苷酶对蔗糖进行水解。 E+S ES P+E 这里，E、S、ES和P分别代表酶、底物、酶底物复合物。根据该模式反应，当底物浓度高到足以使所有的酶转变成ES形式时，第二步反应就成为限速反应，总反应速率对底物浓度升高变得不敏感了。,k2,（一）中间络合物学说,酶和底物形成中间复合物的学说证据：ES复合物已被电子显微镜和X射线晶体结构直接观察到。许多酶和底物的光谱特性在形成ES复合物后发生变化。酶的物理性质，如溶解度或热稳定，经常在形成ES复合物后发生变化。已分离得到某些酶与底物相互作用生成的ES复合物。超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降现象。平衡透析时观察到底物浓度在半透膜内外不同。,（一）米曼氏方程,在一个复杂的动力学研究方案中，产物形成的速率可用生成产物的速率和它的瞬间中间物的浓度来表示。因此，酶促反应的速率可以表达为： v=dP/dt=k2ES ES生成的总速率是它形成的速率和它消失的速率之间的差值： dES/dt=k1ES-k-1ES-k2ES ,为了使这一反应更加完整，必须有两个前提：,快速平衡假定：1913年，L.Michaelis M.Menten假定ES形成和解离能够快速达到平衡，而且k-1k2，那么可以得到： k1ES=k-1ES ks=ES/ES=k-1/k1 这里，ks 是酶底物的解离常数。在生理条件下，即在底物浓度大大地大于酶浓度（S E）的条件下，反应中的各组分的进程曲线如图。,第三节 酶反应动力学,ES和E的数值一般不能直接测定，但总的酶浓度Et Et=E+ES k1 ES=k-1ESES+k2ES 由于E=Et-ES,并代入方程，然后重排，得到 （Et-ES）S k-1+k2 ES k1 将米氏常数Km定义为： Km k-1+k2 / k1 那么方程可重排为： KmES=(Et-ES)S ,解ES,得到如果不考虑E+P形成ES的逆反应，只考虑E和S混合之后的最初反应，即初速率，此时产物基本上为零，由产物P和E形成ES的速率可以忽略。这样可以将初速率(v)描述为底物和酶量的函数：,Et和S实验上是可以测定的。初速率（操作上可按在底物浓度超过10转变成产物之前来处理）的运用简化了一些复杂的因素，如逆反应、产物对酶反应的抑制以及酶进程性失活等的影响。一个反应的最大速率（Vmax）出现在高底物浓度、当酶被饱和时，即当酶完全形成ES时因此，方程可变成：这就是米曼氏方程，它是酶动力学的一个最基本的方程，描述的是一个与血红蛋白同氧结合的曲线图相似的双曲线图。这个方程说明，一种酶在任何一瞬间的催化速率由两个常数（Km和Vmax）以及在那一瞬间的底物浓度来决定。,（二）米氏常数的涵义,可以为Km提供一个工作上的定义即将改写，即得到那么当v=1/2 Vmax时，Km=S。即是说，达到最大半反应速率时的底物浓度可定义为Km。可见Km是有单位的，且与底物浓度单位相同。某些酶的Km如表44所示。,（三）Vmax、Km和反应级常数的关系,一旦知道Km和Vmax，而且假如：反应只涉及一种底物；或者，如果反应是多底物的，那么只改变一种底物的浓度，而其他所有底物的浓度保持恒定。反应ES E+P是不可逆的，或者限定实验，只测初速率。初始底物浓度S0大于总酶浓度Et，并且Et保持恒定。所用其他可能影响反应速率的因素（如温度、pH、离子强度等等）均应保持恒定。在这样的条件下，v即可明确表示酶促反应的速率。,（四）酶单位,在许多情况下，酶的实际浓度是不知道的，但是可以根据测定到的酶活性（活活力）来表示。国际酶学委员会规定了一种国际单位（IU），即在最适条件下，每分钟内催化1mol产物生成所需要的酶量定义为一个酶活性单位。对酶活性单位的另一种定义是开特，一个开特是指每秒钟催化一摩尔底物转变成产物所需要的酶量。因此，1 kat相当于6107IU。在酶学研究中，经常用比活性来表示酶的纯度。比活性是指每毫克蛋白质所具有的活性单位数，用“U/mg”表示。在酶的纯化过程中，每一步纯化过程都需要测定它的比活性。比活性高，表明酶的纯度高。在酶的纯化过程中还要计算两个具有实际意义的指标，即纯化倍数和回收率（产量） 纯化倍数每次比活性/第一次比活性 回收率（）每次总活性/第一次总活性100,（五）转换数,酶的转换数kcat是酶最大活性的一种量度。kcat定义为：当酶被底物饱和时，每分子酶在单位时间内催化底物分子转变成产物的数量。转换数也称为酶分子活性。kcat代表了酶的动力学效应。,（六）kcat/Km,动力学参数kcat和Km对于不同酶的研究和比较具有普遍性用途。每一种酶都有最适合的kcat和Km值，反映出细胞环境、体内酶所正常遭遇的底物浓度以及被催化的化学反应等。不同酶的催化效率的比较需要选择适当的参数。常数kcat并不令人满意。两种催化不同反应的酶可能有相同的kcat，然而它们非催化的速率也许是不同的。因此，由酶所引起的速率提高可能有很大的差别，而且反映的是一种酶当它被饱和时的性质。在低S下，它则失去意义。,常数Km由于它自身的原因也不很令人满意。由于当v1/2 Vmax时， KmS， Km必须对细胞内的正常S有某种关系。对于讨论催化效率来说，最有用的参数应该包括含kcat和Km两者。根据（16），Vmax=kcat Et，代入米曼氏方程（14）得到当SKm时，游离酶的浓度E大体上接近Et，于是就得到v取决于两种反应物E和S的浓度，因而是一种二级反应，常数kcat/Km是二级速率常数。一般认为是用来比较催化效率的最好动力学参数。,（七）Km和Vmax可从直线方程图求解,1、双倒数（Lineweaver-Burk）作图 将米曼氏方程两边同时改写成倒数形式，可得到：,2、Eadie-Hofastee 作图,3、Hanes-Woolf 作图,（八）pH对酶活性的影响,酶与底物的识别以及对底物的催化与pH有极大的关系。酶分子中可解离侧链的排列不仅决定酶蛋白的三维结构和三级结构，而且也与酶的活性部位有着密切的关系。许多酶的辅基也含有可解离基团。底物分子本身往往也含有可解离的基团，它们的这种或那种解离形式也许优先与酶结合。酶的作用环境的pH可以影响酶蛋白的结构、酶活性部位的解离状态、辅酶的解离以及底物分子的解离，从而影响酶与底物的结合以及对底物的催化效力。最适pH：酶只在一个有限的pH范围内是活泼的，大多数酶在一定条件下都有一个特定的pH，在该pH下，酶的活性是最大的。在最适pH下，酶的解离，特别是活性部位的解离最适合与底物结合，能最大限度的发挥酶的催化作用。pH对酶活性的影响必然反映在酶对底物的Km的改变，或者两者兼而有之。,（九）温度对酶活性的影响,像大多数化学反应一样，酶促反应的速率通常随温度的升高而加快。但是，在温度超过5060的情况下，酶的活性明显降低。两种效应在这里起作用： 反应速率随着温度升高而升高； 蛋白质结构在较高的温度下的热变性。,三、多底物酶促动力学,通常，酶催化反应涉及两个（少数情况下三个）底物。这样的反应叫做双底物反应。双底物反应以下面两种路线进行。,（一）顺次反应,顺次反应：所有底物都必须在反应前以及产物释放之前与酶结合的反应。在这样的反应中，被转移的基团直接从底物A进入到底物B，生成产物P和Q。因此这样的反应又叫单置换（取代）反应。顺次反应可以进一步分为有序顺次反应和随机顺次两种机制。 1、有序顺次反应（图411（a） 2、随机顺次反应（图411（b）,（二）乒乓反应,乒乓反应：在所有底物加入之前，一种产物被释放的基团转移反应。第一个底物A（相当于PX）的功能基团（X）被酶从底物上置换，产生第一个产物P和一个稳定的酶形式F（相当于EX）。在F中，X是紧密地（往往共价地）同酶结合（乒）。在反应的第二阶段，X被第二种底物B从酶分子上取代，生成第二个产物Q（BX），酶也恢复到最初的形式（乓）。这样的反应因此而叫做双置换（取代）反应。在乒乓反应中，底物A和B并不彼此在酶分子上相遇。许多酶，包括转氨酶、某些酶都具乒乓反应机制。乒乓反应或者双置换反应是以在双倒数图中的平行线为其特征。,第四节 酶的抑制作用,抑制剂（I）是一类能同酶结合、通过阻止ES复合物的形成或阻止ES转变成E+P反应的化合物。抑制剂在实验室中用于酶作用机制和代谢反应机制的研究，天然的抑制剂可以作为代谢调节剂，在医学上使用的许多药物也是酶的抑制剂。抑制剂可分为可逆和不可逆两种类型。,一、可逆抑制剂同酶的结合都是非共价的,可逆抑制剂通过非共价方式同酶结合。由于它们的结合是非共价的，所以很容易通过透析或者凝胶过滤等方法从酶的溶液中除去。抑制剂从与酶形成的复合物EI中解离的常数称为抑制常数（Ki， Ki EI/EI）。有三种类型的可逆抑制作用，可以通过动力学实验加以区别。,（一）竞争性抑制剂只同自由酶结合,竞争性抑制剂在生物化学中是最经常遇到的一类抑制剂。在竞争性抑制剂作用中，I只能同自由酶结合。当竞争性抑制剂结合到酶分子上时，它便阻止底物同酶的结合，S和I竞争性的同酶结合。最普遍的是S和I都竞争结合酶的同一部位（活性部位）。这种抑制作用称为经典竞争性抑制作用。对某些别构酶，抑制剂结合在酶的不同部位上，虽然对它们的抑制作用表现出竞争性的特征。这种类型作用称为非经典的竞争性抑制作用。,当S和I在溶液中存在时，能形成ES复合物的酶的比例取决于S和I的相对浓度以及酶对S和I的相对亲和力。E I的形成可因增加S的浓度而发生逆转。在足够高的S浓度下，E被S饱和仍是可达到的。因此仍可达到与没有抑制剂存在下的最大反应速率。竞争性抑制剂存在的情况下，最大的反应速率是可以达到的，即不改变反应的Vmax，但却使Km值增大，因为需要更多的底物才能达到最大反应速率。新的Km通常称为表观Km（ Km ）。底物类似物是一类能同酶结合的化合物。这些化合物通常是竞争性抑制剂。这类底物类似物与酶结合后，因不能转变成产物，所以使酶的催化活性丧失。最经典的竞争性抑制剂是丙二酸，它是柠檬酸循环中的琥珀酸的结构类似物，它可以与琥珀酸竞争性地同琥珀酸脱氢酶结合，从而降低该酶的催化活性。,（二）反竞争性抑制剂只能同ES结合,反竞争性抑制剂仅能同ES结合，不同游离酶结合。在反竞争性抑制作用中，Vmax减小（1/ Vmax 增大），因为一些酶分子转变成了无活性的ESI。由于是ES复合物同I结合，Vmax 的降低不能通过加入更多的底物使其发生逆转。反竞争性抑制剂也能降低Km，因为ES和ESI两者形成的平衡由于I的结合有利于向ESI复合物方向移动。代表反竞争性抑制剂浓度变化的双倒数图上的直线都有相同的斜率。这类抑制作用通常仅仅出现在多底物反应中。反竞争性抑制剂不需要与底物相似。,二、可逆抑制剂在实验室和临床上的应用,酶的可逆抑制作用不只是用于酶促反应的生物化学研究，而且也为探索酶的活性部位以及改善疾病的治疗提供了有效的手段。酶的活性部位的形态和化学反应的信息可从一系列的竞争性抑制实验获得。在这样的实验中涉及到系统改变结构的竞争性抑制剂加入到该反应系统中。例如：以乙酰胆碱酯酶为研究对象研究抑制作用。乙酰胆碱酯酶的活性部位有两个分部位，一个阴离子结合部位（底物结合部位）和一个叫做酯部位的催化部位。底物乙酰胆碱和阴离子部位之间的强静电作用可用竞争性抑制剂来研究。,三、不可逆抑制剂与酶共价结合,不可逆抑制剂与酶的某些基团以共价键的方式结合，一经结合就很难分解，必须通过化学反应才能把抑制剂从酶分子上除去。这类抑制剂通过与酶活性部位有关基团的反应而使酶失活。EI共价复合物的形成分两步进行：不可逆抑制剂的重要应用是，通过酶的反应性侧链的专一性置换来鉴定酶活性部位的氨基酸残基。将某种只与一种类型氨基酸反应的共价抑制剂加到酶溶液中，检测保温后的活性丧失情况。,神经毒气二异丙基氟磷酸（DIFP）是一种有机磷化合物，它能使活性部位具有丝氨酸（Ser）的一类水解酶失活。这类酶根据反应专一性称为丝氨酸蛋白酶或丝氨酸酯酶。DIFP与Ser残基反应，产生二异丙基磷酸丝氨酸。某些有机磷化合物在农业上可用作杀虫剂，而其他的这类试剂，例如DIFP对酶的研究则是很有用的试剂。乙酰胆碱酯酶活性部位结构方面的知识可以用来设计解除神经毒气毒害的药物。这个酶的活性部位含有一个丝氨酸残基。强烈的亲核试剂，如羟胺（NH2OH）可以取代与丝氨酸残基结合的磷酸基，使被置换的酶恢复活性。低浓度的解磷定像高浓度的NH2OH一样有效，因为带正电荷的甲基吡啶基能同乙酰胆碱酯酶的阴离子部位结合，使它的亲核性的氧原子接近有机酯化物磷原子。,DIFP曾用来鉴定凝乳蛋白酶活性部位的丝氨酸残基。该酶分子的27个丝氨酸残基中只有一个残基能有效地攻击DIFP的氟磷酸，形成一种稳定的磷酸酯。当具有放射性32P标记的DIFP用于这一反应时，每摩尔的胰凝乳蛋白酶分子中掺入1 mol 的磷酸化合物，使酶失活。置换了胰凝乳蛋白酶用酸部分水解，分离得到具有Asp-32P-Ser-Gly顺序的放射性肽。当该酶的氨基酸顺序完全测定后，可以鉴定出这个被置换过的丝氨酸残基就是Ser195。活性部位指向剂或亲和标记物是一种比普通置换试剂更有用的转移性不可逆抑制剂。这些亲和标记物在一些酶的活性部位结构研究中起到过十分重要的作用。,第五节 酶的作用机制,酶具有高的催化效率，可以使反应速率提高到714个数量级。酶对底物催化是专一性的，很容易区别底物及其结构相似物。催化功能基团不是对酶的催化作用唯一的贡献者。降低活化能所需要的能量通常来自底物和酶之间的弱的、非共价的相互作用。酶和底物结合作用产生的能量叫做结合能。两个基本的、且相互关联的原理为酶的作用机制提供了普遍性的解释： 酶的催化效率最终来自发生在酶和它的底物之间的多种弱的作用和相互作用所释放的自由能。 在反应的转换态中，这样的弱的相互作用已处于最佳状态。酶的活性部位本身与底物是互不相补的，但对反应转换态来说则是互补的，是可以被催化的。,一、酶的底物专一性,“锁钥”模型：底物结合部位处于酶分子表面的凹陷或裂缝中，在形状上是与底物互补的几何互补性，而且形成结合部位的氨基酸以一种有吸引力的方式排列，以便与底物专一性地相互作用。在形态或功能基团分布上与底物不同的分子是不能与酶产生反应性结合的。“诱导契合”模型：X射线研究指出，大多数酶的底物结合部位基本上是预先形成的，但经与底物结合，构象发生某种变化。,锁钥学说,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,诱导契合学说,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,（一）酶的底物立体专一性 酶对它的手性底物的结合以及对反应的催化都是高度专一的。这种立体专一性是因为酶形成不对称的活性部位。这种不对称结构是由于内在的手性所致。 例如酵母乙醇脱氢酶（YADH）催化乙醇转变成乙醛（二）酶的几何专一性 除立体异构专一性外，大多数酶对于底物的化学基团的鉴别是挑剔的。几何专一性比立体专一性具有更严格的要求。 酶对底物的几何专一性方面具有很大的变化。少数酶仅对一种底物起作用，表现出它们的绝对专一性。但是，大多数酶能催化一类相关的化合物。,二、专一性是分子识别的结果,（一）“锁钥” 模型 “锁钥” 模型首先是由有机化学家E. Fischer 于1894 年提出的，是用来解释酶的专一性的。 该模型认为酶活性部位的结构像是一把“锁”，而专一的底物分子是“钥” ，酶活性部位的结构在空间上与专一性底物的结构完全互补的。 “锁钥” 模型的指出，对生物化学的发展起到了很大的影响。但是，酶的结构不是刚性的，而是具有很大的柔性。 酶（E）与底物（S）结合形成的ES复合物也并不是完全互补的，完全互补是与催化无效的。现在一般能接受“锁钥” 模型对酶的专一性和酶促催化的解释，但是加上了一个新的内容，即这把“钥”不是底物本身，而是它的转换态中间物。,（二）“诱导契合” 模型 酶分子具有相当的柔性，是构象上的动态分子。酶分子的许多性质，包括对底物的结合与催化，是它们结构上的柔性的结果。 D. Koshland 提出底物与酶结合是一种相互作用的过程。在酶和底物之间的动态识别过程中，酶活性部位的形态在底物结合时被改变，贴切的说叫做“诱导契合”。底物的结合改变了蛋白质的构象，以便蛋白质和底物彼此更准确“契合”。这个过程事实上是相互作用的过程，包括底物分子的构象也发生改变，以便使它适应蛋白质的构象。,这种见解在某种程度上帮助解释了酶的巨大催化效力：在酶的催化下，构成活性部位的催化残基准确的定向是发生反应的必需条件；底物的结合引起蛋白质构象发生的变化诱导这种准确的定向。催化上有活性的酶底物复合物结构是一种相互作用的结构。在这种结构中，酶引起底物采取一种酷似反应转换态的形式。因而，非最适底物不可能有效地诱导有最适活性地酶转换态中间物构象的形成。酶分子的这种有活性的构象在底物缺乏下应该是相对不稳定的，游离酶因此而回复到一种构象上不同的状态。,三、酶和底物间的相互作用力是催化作用的关键,（一）底物与酶的临邻近极大地有利于酶促反应 化学反应的速率取决于反应物分子的有效碰撞。即是说，取决于如何使反应物有效碰撞形成转换态。为了使碰撞导致产物的生成，碰撞的底物必须正确的定位，必须具备更有效的能量接近产物的原子和键的物理构型。 处在溶液中的反应物分子只有通过彼此相对扩散相遇才有可能发生反应。 对于多底物酶来说，底物分子在酶活性部位的集中，使它们的有效浓度超过了它们它们处在溶液中的浓度。底物结合在催化部位的氨基酸残基附近，增高了两个反应物的浓度。高度有效的底物浓度有利于转换态更为频繁地形成。 这种现象叫做邻近效应，邻近效应需要底物分子同酶弱的结合，即这种结合是低亲和力的。因为非常紧密的结合会使催化变得无效。实验表明，邻近效应对酶促反应的贡献是使反应的效率提高104105。,（二）酶底物复合物的形成伴随着熵减和去稳定转换态出现在活化屏障峰的顶点，必须超过这一能量屏障才能进行反应。在没有催化剂的情况下，能障是S和S之间的能量差。同样地，在有酶催化的反应中，能障是ES和ES 的能量差。这种能量差越小，就越容易达到转换态，转换态的浓度越高，反应的速率就越快。酶的存在能够降低底物和它的转换态之间的能量差。,四、酶能使转换态稳定,ES复合物是不太稳定的，它容易解离成E+S。在ES复合物中，底物与酶的结合并不是处于最适状态，即不是处于完全互补的状态。酶活性部位的基团以及能与底物发生弱的相互作用的氨基酸残基并未全部参与到同底物的结合中去。只有当ES进行转变，进入到转换态ES，才能使底物处于一种最适的结合状态，即，酶与转换态是互补的。 为了使酶结合的底物进入到转换态，就需继续获取能量，达到转换态所需要的自由能。其中大多数所需要的能量涉及到远离敏感键的部位。酶和它的底物非反应部分间的相互作用提供催化反应所需的一部分能量。这种能量的补偿使得反应所需的活化能进一步降低。 酶在转换态对反应物的结合具有很高的亲和力。,五、酸碱催化,两种类型的酸碱催化： 特指（或狭义）的酸碱催化，是指H+和OH-对反应的加速； 广义的酸碱催化，是指质子的供体（酸）或质子的受体（碱）对反应的加速。 特指的酸碱催化和广义的酸碱催化在实验上是可以区别的。狭义的酸碱催化不会受缓冲液浓