二基本知识及基本技术

Genetic Engineering,1.基因工程概述2.基因工程的基础知识与基本技术3.基因工程所需基本条件4.基因工程的操作过程5.目的基因的获取6.克隆基因的表达7.转基因生物技术,二  基因工程的基础知识                   及基本技术,有关基因的基础知识 基因工程的支撑技术,A 有关基因的基础知识,基因的结构特点 基因表达 操纵子学说,第一节   基因的结构特点,基因: 产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核        苷酸序列,由结构基因和调节基因组成.结构基因: 转录成各种RNA直接行使功能;转录成          mRNA,翻译成功能蛋白质.调节基因: 调节或限制其他基因活性的基因,如启动子,          增强子,终止子等.,一、原核生物基因结构特点,DNA    1) 结构简练   2) 存在转录单元   3) 有重叠基因mRNA   1) 半衰期短   2) 以多顺反子形式存在   3) 存在SD序列,二、真核生物基因结构特点,DNA    1) 不连续性   2) 高度重复序列-卫星DNAmRNA   1) 5帽子结构   2) 具ploy(A)尾   3) 单顺反子,第二节   基因表达,就是基因转录及翻译的过程。在一定调节机制控制下，大多数基因经历基因激活、转录及翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子，但并非所有基因表达过程都产生蛋白质， 编码tRNA、rRNA基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。,定义:,一、原核生物基因表达,转录与翻译几乎同时发生,表达调控主要发生在转录水平上.,RNA聚合酶（RNA polymerase）的作用是转录RNA。原核生物RNA聚合酶有比较复杂的亚基结构。如大肠杆菌RNA聚合酶有四条多肽链，另有一个促进新RNA分子合成的因子，因此它的组成的是2。这种结构称为全酶（holoenzyme）,除去了因子的酶称为核心酶。 因子,识别DNA上的启动子,提高聚合酶与启动子的亲和力.,二、真核生物基因表达,第三节   操纵子学说,Jacob和 Monod对大肠杆菌乳糖发酵过程酶的适应合成及一系列有关突变型进行深入研究,于1961年提出了乳糖操纵子模型,开创了基因表达调节机制研究的新领域.操纵子:基因表达的协调单位,有共同的控制区和调节系 统.包括在功能上彼此有关的结构基因和控制部位.乳糖操纵子:       阻遏子I     启动子O    操纵子P        结构基因Z Y A,乳糖操纵子基因表达调控模型,二、操纵子调节的类型,1 代谢产物对基因活性的调节        正调节         负调节2 降解产物对基因活性的调节3 环腺苷酸受体蛋白对转录的调控,可诱导:乳糖操纵子可阻遏:色氨酸操纵子,B 基因工程的支撑技术,DNA的提取与纯化 电泳技术 聚合酶链反应(PCR)技术 核酸分子杂交 DNA序列分析 基因定点突变技术 酵母双杂交系统,第一节  DNA的提取与纯化,由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。,一、质粒DNA的提取,Genomic DNA,plasmid DNA,The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,（1）原理,1 碱抽提法提取质粒DNA,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,染色体线性DNA或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。,变性,（2） 所用的试剂作用, 溶菌酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH>8）下有活性。, 葡萄糖,增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。,EDTA,Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA  双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。,冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。,高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。,用于沉淀DNA。, 乙醇,DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。, NaAc-HAc缓冲液, RNase A,降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。, TE缓冲液,DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。,Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。,蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀,但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。, 酚-氯仿,选用,以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。,（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤,Solution I 的配制：,使用“溶液”溶解细菌细胞壁。,第一步：溶菌,50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A,溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。,第二步：破膜，蛋白质和DNA变性,Solution II 的配制：,第三步：中和,溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。,Solution III的配制：,0.2N NaOH，1.0%SDS,3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）,上清液中含有闭合质粒DNA。,第四步：离心除去沉淀,0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。,第五步：纯化DNA,上清液过柱或酚-氯仿抽提。,第六步：沉淀DNA,最重要的是：,2.影响质粒DNA产量的因素,菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。,一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。,（1）受体菌株,endA基因编码核酸内切酶，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。,这是直接决定DNA产量的重要因素之一。,（3）质粒大小,分子量大的质粒，拷贝数少。,（2）质粒拷贝数,质粒本身的性质所决定。,二、基因组或其他DNA的提取,1 细菌基因组DNA的制备,（1）细胞裂解,10%SDS和蛋白酶K。37 oC温育。,不用NaOH !,（2）DNA纯化,CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。,（3）沉淀DNA,0.6倍体积的异丙醇。,动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。   组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。,（1）组织粉碎,2 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提,（2）细胞裂解,0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。,SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。,（3）纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,（5）除去RNA污染,用RNase。,用2倍体积的无水乙醇。,（4）沉淀DNA,（可以加入1/10体积的3M醋酸钠辅助沉淀）,（1）组织粉碎,用液氮冷冻后研磨成细粉末。,3  从植物组织中制备 DNA,（2）细胞裂解,用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。 或1% SDS和蛋白酶K,65 oC温育。,用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）。,（3）纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,（4）沉淀DNA,（5）除去RNA污染,用RNase A。,（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。,三、DNA的定量和纯度测定,1 紫外光谱法,DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。,用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。,原理：,蛋白质在280nm处有吸收峰,溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发红色荧光。,2  琼脂糖凝胶电泳估计,原理：,与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。,一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。,DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如DNA的Hind酶切物等。,四、DNA分子量的估计,Marker,DNA  ladder,28kb,2500bp,2300bp,1300bp,900bp,750bp,200bp,5000bp,20kb,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp,DNA Marker,1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。,一、电泳的基本原理,第二节  电泳技术,4.,如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）： 分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。,摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。,5.,Relaxed,supercoiled,Increasing degree of supercoiling,相同分子量的DNA:,闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。,二 、琼脂糖凝胶电泳,1. 琼脂糖,2. 琼脂糖凝胶,琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。,是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。,琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高,空隙小,空隙小，分辨率高：    小分子较易通过，而大分子难通过； 空隙大，分辨率低：    大小分子几乎以同等速率通过。,3.琼脂糖凝胶的分辨力,空隙大小决定其分辨分子大小的能力。,4.低熔点胶(LMP),熔点为62-65,可在37下保持液体状态数小时,25下保持10分钟.低熔点琼脂糖回收DNA直接进行酶切处理,5. 电泳所用溶液,TBE(5)缓冲液:Tris-Base,硼酸,EDTA-Na2 加样缓冲液:溴酚蓝,蔗糖水溶液,EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。,2) 原理,Ethidium bromide （EB）,1) 染料,溴化乙锭,6. 凝胶染色,UVP全自动凝胶成像分析系统,OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统,优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。实用于蛋白质分离分析及DNA序列测定,三 、聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳：20050000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：11000bp,1 SDS-PAGE电泳所用溶液,SDS-PAGE电泳缓冲液:即Tris-甘氨酸(5)         每升含有:15.1g Tris碱,94g甘氨酸,50ml 10%(W/V)电泳级SDS贮存液。使用缓冲液为1Tris-甘氨酸缓冲液。SDS-PAGE 加样缓冲液(2):       100mmol/L TrisCl(pH6.8),6%-巯基乙醇,4%SDS(电泳级),0.2%溴酚蓝, 20%甘油,4贮存。SDS-PAGE电泳所用15%分离胶(20 ml):       水4.6ml,30%丙烯酰胺溶液10ml,1.5mol/L Tris (pH8.8) 5 ml,10%SDS0.2 ml,10%过硫酸铵 0.2ml,TEMED 0.008ml。,SDS-PAGE电泳所用5%浓缩胶(8 ml):       水5.5 ml,30%丙烯酰胺溶液1.3 ml,1.0mol/L  Tris (pH6.8) 1.0ml, 10%SDS 0.08 ml,10%过硫酸铵 0.08 ml,TEMED 0.008ml30%丙烯酰胺贮存液:        29% (W/V) 丙烯酰胺加 1%(W/V) N N-亚甲基双丙烯酰胺,以双蒸水溶解,用滤纸过滤溶液,去除不溶杂质,确定溶液pH值不超过7.0,置于棕色瓶4保存。,2 染色,考马斯亮蓝R250或银染,Marker,一、基因扩增（gene amplification),指在生物体内或体外采用人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：,1. 环境诱发扩增,2. 基因的程序性扩增,5. PCR扩增,3. 基因组进化扩增,4. 基因工程扩增,第三节 聚合酶链反应(PCR)技术,1. 环境诱发扩增,如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。,在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。,在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。,2. 基因的程序性扩增,如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。,生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。,5. PCR扩增,应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。,3. 基因组进化扩增,4. 基因工程扩增,载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。,（1）,1. PCR的发明,二、PCR技术,（2）,Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。,1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。,1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。,当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。,(Polymerase Chain Reaction),（3）Taq DNA 聚合酶,1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使 PCR自动循环仪成为可能。,（4）PCR 仪,1988年 Cetus公司发明自动热循环仪。,1986年 H.A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。,2. PCR技术的原理,模板DNA变性,引物DNA复性,引物DNA延伸,双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,TAGAACTTG,ACGTACGTA,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,3,3,5,5,3,TAGAACTTG,ACGTACGTA,95oC,（1）DNA模板变性,模板,模板（template）,95oC,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。,（2）DNA模板与引物复性,模板,模板,ATCTTGAAC,5,3,ACGTACGTA,5,3,引物,引物,引物（primer）:,40-65oC,DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。,（3）DNA链的延伸,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,模板,模板,ATCTTGAAC,5,ACGTACGTA,5,Taq,Taq,72oC,理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。,变性复性延伸。,（4）1个循环的结果,（5）新一轮循环开始,3.   PCR的过程,（1）第一步     变性（denature）,94-95 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。,在0.5mlEP管中依次加入以下成分:10PCR缓冲液   5l；           MgCl  3l；dNTP                    4l；           引物1,    2l； TaqDNA聚合酶   0.5l            引物2 , 2l；  HaSNPV基因组DNA      1l；ddHO补至50l。加矿物油30ul于反应混合物表面，以防止加温过程中液体蒸发。,94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。,（4）第四步     变性（denature）,72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。,（3）第三步     延伸（extend）,（5）第五步     重复（repeat）, 引物的浓度高， 引物的链短。,50-60 oC下1分钟，引物优先与模板复性。,（2）第二步     复性（anneal）,目的基因,5,变性,加热,引物,退火,底物,聚合,5,5,加热,变性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,需要的模板量极低。,（1）特异性强, PCR使用专门合成的DNA引物。 延伸过程是在高温下进行。,（2）敏感性高,这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反应的特异性。,理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！,4.   PCR的特点,RT-PCR：,对模板的纯度要求低。,（5）可以扩增mRNA,（4）简便,先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。,（3）快速,整个PCR过程约4小时即可完成。,不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。,自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。,（1）Taq DNA聚合酶,5. 影响 PCR的因素,Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。, 热稳定性,最适温度：       75-80 oC 最长延伸长度：6.7kb, 最适温度高, Taq酶的功能缺点,具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！,合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，一般PCR中出错率为210-4 核苷酸/每轮循环。用于克隆基因时必须测序。,金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。, Taq DNA聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。,Taq的PCR产物3端往往带有一个A。,（2）其它耐热的 DNA聚合酶,Tth DNA聚合酶,无3 5DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。,VENT DNA聚合酶,有35外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100oC高温。, Pfu DNA Polymerase, Taq Plus DNA Polymerase,有3 -5的外切酶活性，5-3外切酶活性。,但PCR产物为平端！,是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。,是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。,与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（ 5端相同）的短DNA。,（3）引物（primer),位置,3,3,引物的长度,一般引物设计为长1530bp。太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成,引物的碱基序列,5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。,5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3,3GCTAGCTACTTAAG5,3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。,template,primer,尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力，G+C含量通常为40%-60%,引物的碱基组成,避免连续相同碱基排列或内部回文序列.,5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1）,2）,3）避免形成引物二聚体（dimer）,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,5GGTCTGCCAGTCTAC3,3CAGGACTTAGTCACT5,primer1,primer2,  引物的Tm值,Tm=（G+C)4 + (A+T)2,当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55  oC。,适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。,实际复性温度选择低于Tm值5 oC。,手工计算：,一般估计：,引物的浓度,一般使用终浓度各0.5mol/L。,简并引物,如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。,设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。,引物设计现在多用专业软件如Primer5.0等,套嵌引物（nested primers),1,3,2,4,但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。, 模板的量：,不能太多，100l反应体系中100ng足够。, 纯度：,PCR对模板DNA的纯度要求不高。,（4）模板（template),dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。,（5）dNTPs,一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。 浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。,Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。,（6）Mg 2+ 的浓度,所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。 一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。,借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。,6. PCR技术的扩展,（1）荧光实时定量PCR,Realtime  PCR（或TaqMan  PCR ）,Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。,扩增两个引物外侧的未知序列,（2）反向PCR,把线性DNA模板转变成环形分子。,template,template,3,5,5,3,（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。,技术关键：,使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。,（4）反转录PCR（RT-PCR),Temin,H.发现反转录酶， 1975诺贝尔奖,技术关键：,利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。,（1）提取基因组 total RNA,（2）反转录合成总cDNA作模板,（4）PCR扩增,（3）根据目的基因序列设计引物,原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。,适合扩增真核生物基因。,目的基因 的引物1,反转录成目的基因cDNA第一链,目的基因 的引物2,目的 基因cDNA第二链,PCR,mRNA,7. PCR技术的应用,（1）扩增某一段DNA,从基因组中扩增； 从载体上扩增； 组织样本原位扩增； 微量残留DNA扩增； 分析模板序列；,在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,（2）基因的体外诱变,技术关键：,利用引物的5端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。,利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。,（3）基因组的比较研究,比较不同物种之间的基因组特征和相似性。,类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。,RAPD (Random amplified polymorphism DNA),第三节  核酸的分子杂交,当带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起时,其特定的同源区段会退火形成双链结构,如果彼此退火的核酸来自不同的生物,则所形成的双链分子就叫杂种核酸分子.     广泛地应用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。,A 基本理论                  DNA变性                  DNA复性                  核酸分子杂交B 印记    在杂交反应中,经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子都是在杂交之前通过毛细管作用或电导作用被 转移到滤膜上,且按其在凝胶中的位置原位地”复印”上去.,C 杂交的一般程序    DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素 （32P或125I）标记的DNA或RNA探针。,核酸探针       在退火时能与被测样品中的目的DNA相应序列互补的已知核酸片断.人工合成的寡核苷酸,基因组DNA,特异的PCR产物,cDNA,单链DNA及RNA.,探针标记物要求:        不影响探针的主要理化性质;灵敏度高,特异性强,重复好;操作简便;稳定性高,易于保存;安全,无污染.,标记物的类型:      1)放射性标记物:用放射性同位素对核苷酸进行标记后的产物.32P.3H.35S.14C      2)非放射性标记物:无放射性污染,分辨力高,稳定性好,但敏感性及特异性较差.生物素标记的核苷酸.标记探针的方法:       1)体内标记       2)体外标记:化学法和酶促法,一、Southern blot,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,D 常用分子杂交类型,Southern blot 筛选结果,二、Northern blot,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。用于研究基因表达,变性凝胶电泳:单链RNA易形成高级结构,使用变性剂有甲醛,乙二醛,尿素等.电泳过程中始终要有抑制RNase作用杂交前,干燥后的固相膜会由于变性剂的存在而干扰杂交灵敏度,先将膜泡在Tris-His缓冲液中95度5-10分钟,可洗脱与RNA结合的甲醛.,三、原位杂交,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,需要目的基因的探针,四. 组织原位杂交五. 斑点杂交六 .免疫印记,1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：,当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离开的技术。 当时的分析思路局限于RNA序列分析法。,第五节   DNA序列分析,（1965年Cornell大学的S.W. Holley等首次测定了75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片断法）。,Sanger等1977年发明。,一、双脱氧链终止法,Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖,（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配         对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以35磷酸二脂键。 （3）复制反应可以在体外进行。 （4）2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。,1. 原理,（1）制备单链DNA模板,2. 技术要点,就是待测序的  DNA链。,不能有53和35的外切酶活性； 与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。,（3）特殊的DNA多聚酶,dNTP / ddNTP = 3 / 1时, DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。,（4）制备2和3双脱氧的ddNTP,需带有放射性或荧光标记。,（2）制备一小段单链引物（DNA或RNA）,或将ddNTP带上标记,3. Sanger双脱氧终止法测序过程,模板序列,1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明。,二、Maxam-Gilbert化学修饰法,Walter Gilbert,  1980年Nobel Prize化学奖,末端放射性标记 的DNA片单链,长度最少差一个核苷 酸的DNA链混合物,化学试剂处理,凝胶电泳,放射性自显影,阅读碱基顺序,特定的碱基中 引入化学基团,DNA在被修饰的 核苷酸位置断裂,1. 原理,2. 碱基特异的化学切割法,3. 测序过程,每组反应只针对特定的碱基，共有4组反应，可分别显示G、A+G、C、C+T的终止位置。,特点：,读出的序列就是要测的序列。,Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。,测序读片,三、DNA杂交测序,90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。        用特定长度的具有所有可能碱基序列的寡核苷酸群体,与未知序列的 DNA片断杂交,根据某些寡核苷酸探针形成的完全双链推知目的DNA的碱基序列.,1. 原理,（1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形         成完全的双链分子。杂交效率最高。,（2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。 （3）非互补碱基越多，杂交效率越差。,（4）用一段寡聚核苷酸（8-mer）的所有可能的碱基排列序列作探针。,8mer探针有48= 65536 种序列。,如： 8-mer靶DNA 同65536中的一种探针完全杂交形成完全互补双链。,（5）根据杂交效率可推断出靶DNA的序列。,5-AGCCTAGC-3,Target,3-TCGGATCG-5,Probe,假如探针序列已知，则可推知靶DNA序列。,但： 12mer靶DNA 与8-mer探针杂交，将会有5种探针与之形成完全互补双链。,3-TCGGATCG-5   3-CGGATCGA-5      3-GGATCGAC-5         3-GATCGACT-5             3-ATCGACTT-5,5-AGCCTAGCTGAA-3,12-mer target,8-mer probe,假如知道能与之完全杂交的所有5种探针序列，就可推知12bp的靶DNA序列。,（1）DNA芯片（chip）,把寡聚核苷酸探针的3端或5端与玻璃或凝胶形成共价连接。不同碱基组合的寡核苷酸小区排列在一起形成探针点阵.目前可以做出65536 种8-mer探针芯片。,2. 技术要点,每种探针的序列和位置已知，可被电脑读出。,(2),（1）非放射性标记,1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。,四、DNA自动化测序,荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。,1. 技术要点,（2）不同的标记对象,既可标记引物，也可标记ddNTP。,（4）分析自动化,（3）读片的自动化,激光探头直接读胶，实时阅读。,（2）反应的自动化,Sanger脱氧终止法。,电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。,（5）反应可在一个试管中进行,标记ddNTP时。,2. 荧光标记引物的自动化测序,分别用4种荧光物标记引物， 区分反应产物， 混合电泳， 激光一次读胶， 电脑合成结果。,3. 荧光标记ddNTP自动测序原理图解,4种不同的荧光物分别标记4种ddNTP,可在同一管中进行,可在单一泳道电泳。,测序结果,第六节  基因定点突变技术,基因突变：基因组DNA分子在结构上发生碱基                     对中组成或排列顺序的改变,并引起                     个体表型的改变,而使生物体发生遗                     传变异.分为自发突变和诱发突变.,A 寡核苷酸介导的基因突变:        1 寡核苷酸引物诱变技术         2 盒式诱导突变,1 寡核苷酸引物诱变技术,使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片断作为引物,启动单链M13噬菌体DNA进行复制,随后这段寡核苷酸引物成为新合成DNA子链的一个组成部分,新生的子链便具有发生突变的碱基序列.,原理:,技术条件:,载体     引物,2 盒式诱导突变,以各种双链质粒DNA为载体,采用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片断置换待改造基因中两个限制酶切点之间的序列,在转化的大肠杆菌中形成数量众多的突变体.这些突变体就好象不同的盒式录音磁带,可随时插入制备好的质粒中.,B  PCR定点突变技术,应用PCR技术在DNA模板中预先确定的位置上引入单个或多个碱基的改变.,1 引物PCR定点诱变法2 重组PCR定点诱变法,第七节   酵母双杂交系统,Yeast Two Hybrid System (Interaction trap),90年代，纽约大学的S. Field等建立。,有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的