四基因工程的操作过程VIP

Genetic Engineering,1.基因工程概述2.基因工程的基础知识与基本技术3.基因工程所需基本条件4.基因工程的操作过程5.目的基因的获取6.克隆基因的表达7.转基因生物技术,4 基因工程的操作过程,A 重组体的构建（切、接）,B 重组体导入受体细胞（转、增）,C 重组体的筛选和鉴定（检）,切,接,转,增,检,目的蛋白,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,（受体细胞）,A 重组体的构建,粘性末端的连接,平末端的连接,PCR产物的连接,DNA体外连接应注意的事项,载体和外源DNA插入片段的连接结果,一、粘性末端的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。,1. 两段DNA的连接,依靠粘性末端,2. DNA片断与载体的连接,1）同种酶产生的粘末端连接插入,正反向插入 载体、外源基因自我连接 载体和外源基因混连,ligase,nick,2）定向连接置换,用产生不同粘末端的两种限制性酶消化载体与外源DNA,避免了载体和插入分子自我连接 以固定方向重组 有些载体的粘末端形成少量碱基互补，形成开环,二、平末端（blunt end）的连接,5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。,1. 直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%10 % 。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,2. 获得平末端的方式,（1）用产生平末端的内切酶切割 载体和外源DNA,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37 ,5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5,（2）用Klenow聚合酶补平或S1核酸酶切平获得,Klenow酶拥有53的DNA聚合酶活性,S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA,1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。,（1）同聚加尾法,3. 人工加尾形成 “粘性末端”,DNA末端转移酶(TdT)能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。,原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,加尾碱基互补,平末端变为3突出末端,用5 特异核酸外切酶或能产生3 突出末端的内切酶消化。,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来，且避免载体和外源DNA自身环化,不能把插入片段再切下来。,非酶切位点,用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。,（2）衔接物(linker)连接, linker,用化学合成法合成的一段10-12bp的具特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoRI linker：, linker的作用,缺点：,1）可以用内切酶把插入片段切下来。,如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段。,2）能给载体连接上Polylinker,优点：,（3）DNA接头 (adapter)连接法,1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。,5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5,BamHI adapter,用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。, adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。, adapter的作用,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5p-GATCCCGG- GGCC-,-CCGG -GGCCCTAG-P5,5p-GATCCCGG- GGCC-,CCGG GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5,接头自我连接,T4DNA连接酶,接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。,优点：,连上后就能用。,缺点：,先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）,防止自我连接,5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P,P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5,接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！,5GATCCCGG-OH HO-GGCC5,5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5,CIP处理,-OH,HO-,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5GATCCCGG- HO-GGCC,CCGG-OH -GGCCCTAG5,5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5,缺口,缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4 ligase,虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。,三、PCR产物的连接,1. 在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点；,（1）设计原则,（2）带酶切位点的引物的结构,3端1520bp与模板互补； 5端610bp是某个内切酶的识别序列。,（5端多余的35bp属保护碱基）,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,EcoRI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互补序列 PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,3,GGATCCCGG,互补序列,模板,BamH I 位点,-5,3-,5,复性,延伸,模板,模板,3,3,GGATCCCGG,互补序列,-5,3-,模板,5,GCTAGCCGG,PCR产物 互补序列,-5,3-,引物2,带酶切位点的PCR产物,GCAGAATTC,PCR产物,5-,-3,CCTAGGCGG,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,GGATCCGCC,EcoRI位点,BamHI位点,AATTC,PCR产物,5-,-3,CCTAG,PCR产物,-5,3-,G,G,EcoRI,BamHI,两头各有一个粘性末端！,2. 与T载体直接连接,（1）PCR产物两个3端一般都有一个A,Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。,（2）T载体的两个3端人为地各加一个T,利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA聚合酶,载体,PCR产物,TA,TA,pCR2.1的MCS,四、DNA体外连接应注意的事项,插入片断与载体的酶切位点互补,相同的粘性末端才能有效地连接。,尽量避免平端连接。,决不能进行非粘性末端连接。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII,都产生“GATC”4个碱基的粘性末端。,2. DNA插入的方向正确,用双酶切,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,3. 防止载体自身环化连接,（1）提高插入片断的用量,连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上,（2）用碱性磷酸酶处理载体,载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。,5,3,载体,插入片断,1. 载体自身环化连接（能存活）,2. 载体之间互相连接（能存活）,3. 插入片段互相连接（不能存活）,4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）,五、载体和外源DNA插入片段的可能连接结果,5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）,B 重组体导入受体细胞,重组子导入原核细胞（E.coli）重组子导入真核细胞 酵母菌、植物细胞、动物细胞,1. 目的,增加受体菌细胞膜的通透性。,一、感受态大肠杆菌的制备,重组子导入原核细胞,使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。,2. 菌种,3. 制备原理,0的CaCl2低渗溶液中，细胞吸水膨胀，同时Ca2+与加入的DNA分子结合，形成抗DNase的羟基磷酸钙复合物，粘附在细菌细胞膜的外表面上，当42热刺激短暂处理细胞后，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子进入提供通道。,4. 制备过程,培养大肠杆菌,OD600至0.3-0.4,On ice 5-10 min,4离心收集菌体,用冰冷的60mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70 冻存,用冰冷的60mMCaCl2重悬（体积减少）,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重悬,二、重组DNA导入大肠杆菌,（1）转化（transformation),大肠杆菌捕获重组质粒DNA的过程。,（2）转染（transfection),大肠杆菌捕获重组噬菌体DNA的过程。,1. 外源DNA导入细菌的几种方法,（3）转导（transduction),借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。,每gDNA转化成功的细菌克隆数。,3. 转化方法,2. 转化率,简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。,（1）热休克法（heat shock）,高压电脉冲在细胞膜上电穿孔，形成可逆的瞬间通道。转化效率高（高于109/gDNA）。,（2）电转化法,10ng载体DNA,100L感受态菌,On ice混合，静置30分钟,42C 1分钟,加入1mL LB培养基,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,（吸附DNA）,（摄入DNA）,（1）热休克法,迅速移入冰浴35min,LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分钟，2离心集菌,低盐buffer重悬菌体,2 离心集菌,低盐b重悬菌体,2 离心收集菌体,少量冰冷的b重悬,分装成 50-300L,电转仪调为2.5kV,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,On ice混合,加入1mL培养液,37 中速震荡60分钟,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,转化,（2）电转化法,4. 平板培养基培养细菌,10-100L转化液,涂于含抗菌素的平板,37过夜,Notice:设对照！,线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。,（1）重组质粒,5. 影响转化率的因素,分子质量越小，转化率越高（30Kb难）自然双螺旋闭环结构比开环转化率高,生长状态,制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。,必须在冰冷的条件下制备。,储存感受态菌要在-70以下,CaCl2处理,使用感受态菌时必须迅速融化,融化后一般不能再次冻存使用。,（2）感受态细胞 （competent cells),（3）转化手段,电穿孔法比热休克法转化率高。,把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。,6. 体外包装的噬菌体的转导,（2）体外包装（in vitro packaging）,（1）转导（transduction）,通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。,cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，噬菌体感染细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到4445时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成，便于提取外壳蛋白。,（3）cI857基因突变的噬菌体,但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。,cI857,其它基因,溶源状态（DNA不转录、不翻译）,DNA,阻遏 蛋白,阻遏 蛋白,4445,DNA转录、翻译合成外壳蛋白,32,噬菌体1,外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。,在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。,（4） 互补型噬菌体,外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部）。,噬菌体2,(5) 体外包装过程,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。,（6） 转导,转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）;,一、导入酵母细胞,1. 菌株选择,如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his31,重组子导入真核细胞 酵母菌、植物细胞、动物细胞,（1）利用原生质球进行转化,2. 酵母的转化方法,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、 PEG,插入外源基因 的酵母载体,pEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。 CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。,转化,酵母,0.1mol/L LiCl处理,插入外源基因的酵母载体,感受态,40% PEG 4000,（2）利用Li+盐进行转化,二 导入植物细胞,A 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法,几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti（Tumor-inducing）介导的。 Ti质粒的TDNA区可携带任何外源DNA整合到植物基因组中。,转化方法： 叶盘转化法 整体植株接种转化法 原生质体共培养转化法,叶盘,消毒,切取,土壤农杆菌浸泡,看护培养基,愈伤组织,分化幼苗,叶盘法（leaf disk),植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,1-2kV电击,愈伤组织,幼苗,分化,1. 电击法（electroporation),B 直接转移法,又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)，利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞的现象，将包在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带入细胞内。,DNA,1.2m钨弹头,吸附,特制手枪,射击植物细胞,装入,2.基因枪法（gene gun）,CaCl2、PEG,3.激光微束穿孔转化法,直径小、能量高的激光束可引起细胞膜可逆性穿孔。先在荧光显微镜下找出合适的细胞，用激光源代替荧光，发生激光束脉冲造成膜穿孔，使周围DNA进入细胞。,4.超声波介导转化法,利用低音强脉冲超声波的物理作用，可逆性击穿细胞膜。可减少对细胞的损伤。,5.显微注射法,用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核。关键步骤：固定细胞,6.多聚物介导法,多聚物如PEG、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸和二价阳离子（Mg2+、Ca2+）与DNA混合，可在原生质体表面形成沉淀颗粒，同时引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞间识别，使原生质体内吞噬外源DNA.,琼脂糖包埋法、多聚赖氨酸连结法、吸管支持法,将外源DNA涂在授粉的枝头上，使其沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。,8.花粉管导入法,7.脂质体介导法,用人工构建的磷脂双分子层组成的膜包裹DNA，通过脂质体与原生质体的融合或原生质体的吞噬，把外源DNA转至细胞内。可与PEG结合使用。,（1）原理：,三、导入哺乳动物细胞,1. 磷酸钙沉淀法,HEPES缓冲液与含有氯化钙DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙DNA的沉淀。哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的磷酸钙DNA沉淀物。,依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。,（2）操作过程,脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）,2. 脂质体（lipofectin）介导法,脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。,直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。,3. 显微注射法(microinjection),二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。,4. DEAE-葡萄糖传染法,葡聚糖,葡聚糖+DNA,吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。,DEAE-dextran,细胞,外源DNA,预处理,摄入,DEAE-dextran,外源DNA,细胞,混合,DEAE-dextran对细胞有毒!,外源基因导入细胞的方法,C 重组体的筛选和鉴定,C 重组体的筛选和鉴定,依赖于表型特征筛选法,依赖于重组子结构特征分析筛选法,核酸分子杂交检测法,免疫化学检测法,转译筛选法,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。,转化子,重组子,期望重组子,A 抗药性标记筛选,人工构建的质粒、柯斯质粒、噬菌体质粒都带有抗药性基因作为筛选标记，正向选择，初步筛选。如pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。,第一节 依赖于表型特征筛选法,一、利用载体提供的表型特征筛选,pBR322,pHC79,MCS,pUC18/pUC19 ori,Ampr,lacZ,lacI,M13 ori,3.2kb,pUC118/119,（1）四环素抗性基因：,（2）氨苄青霉素抗性基因：,1. 常用抗性遗传标记,产生-内酰胺酶，可降解环境中的Amp，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,表达能改变细胞膜的蛋白，防止Tet进入细胞后干扰蛋白合成。,（3）氯霉素抗性基因：,表达氯霉素乙酰转移酶（CAT），使Cm乙酰化而失效。,（4）卡那霉素抗性基因：,表达能修饰Kan的酶，阻遏Kan对核糖体的干扰。,2. 注意问题,1、做对照。2、观察时间不易过长。3、得到的不一定是期望重组子，需进一步鉴定。,B 插入效应筛选,利用外源DNA与载体的特定部位连接后，引发载体功能的改变。,1. 插入失活法,1）原理：,pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。,pBR322,（1）四环素：,（2）氨苄青霉素抗性基因：,2） pBR322抗菌素标记选择,产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（3）环丝氨酸：,3）选择过程：,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（1）四环素抗性插入失活,无环丝氨酸培养基,（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。,2. 插入表达筛选法,将一段负调控序列重组到标记基因上游，用于抑制标记基因的表达。当外源DNA插入在负调控序列内使其失活位于下游的标记基因才能表达。,-半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,+,+,深蓝色,1. 原理：,载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。,C. -半乳糖苷酶显色筛选,2. 选择过程,-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。,利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择（只在特定条件下），要求克隆的基因片段至少是一个完整的基因序列，而且能在大肠杆菌中实现表达。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,1.弥补缺陷,his-,his+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,二、利用插入序列提供的表型特征筛选,小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含DHFR的克隆才能生长,例：,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2. 增加新性状,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大的原理。,一、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。使用于较大外源DNA片段。,分子量 Marker,载体,重组克隆,第二节 依赖于重组子结构特征分析筛选法,二、酶切电泳筛选法,1. 原理：,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,2.筛选过程：,A,B,A或B,酶切电泳筛选法,不同克隆的酶切结果,三、PCR扩增检测法,1. 原理,PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,2. 过程,（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。,（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。,（3）电泳PCR产物。,（4）检查是否有PCR产物。,（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。,1. 核酸杂交,第三节 核酸分子杂交检测法,一、原理：,重组克隆与探针杂交,3. 识别标记,32P 、 125I 、35S 、14C,（1）放射性同位素：,2. 检测用的探针,与外源DNA插入片断互补的序列。,（2）非放射性标记：,荧光素、生物素、地高辛,二、核酸杂交检测方法,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,1. Southern blotting,从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。,只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,酶切前,酶切后,插入片断,载体,Southern blot 筛选结果,2. Northern blotting,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,3.菌落原位杂交筛选,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,一、放射性抗体检测法,第四节 免疫化学检测法,对表达产物的检测；蛋白蛋白“杂交”,一种抗原产生的免疫血清中含有几种IgG抗体，分别识别抗原上的不同决定簇，并与之结合。抗体分子的某些部位如Fc片段可与某些固体基质结合，不会被洗脱掉。体外碘化作用，可将抗体用放射性同位素标记。,依据,待测基因 产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二抗 结合蛋白,125I标记的二抗,1. 抗体与产物的结合方式,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,125I 标记的A蛋白,2. 放射性抗体检测法过程,3. Broome-Gilbert双位点检测法,质粒基因A,插入基因B,表达融合蛋白,质粒蛋白A,外源蛋白B,检测融合蛋白,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,固相支 持滤膜,抗A抗体,125I标记的 抗B抗体,质粒蛋白A,外源蛋白B,质粒蛋白A,外源蛋白B,固相支 持滤膜,抗A抗体,发光，底片曝光,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,1. 原理,抗原抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,2. 方法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,三、非放射性抗体检测法 酶联免疫吸附测定（ELISA）,Enzyme-linked immunosorbant assay,1. 原理：,一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,2. ELISA检测的一般步骤,（1）固定样品,将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。,孔底,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,（2）一抗结合,一抗,加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,（3）二抗结合,二抗,加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,（4）显色反应,在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。,（5）比色,3.ELISA的局限性,有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。,最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）,临床检验常用的单抗,四、免疫印迹（western blotting）法,1.原理：,在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。, SDS:,（SDS-PAGE）：, 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：,（Polyacrylamide gel electrophoresis）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。,电泳buffer,电泳buffer,点样,电泳方向,蛋白质电泳的分子量标准,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,Da,道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为61023道尔顿,Dalton,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。,硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。,2）转到膜上进行染色。,1）直接染色,直接染色电泳结果,（2）Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。, Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,Western装置, Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物， 并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结