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疟原虫镜检技术手册目 录第一章 疟原虫生活史3第一节 在人体内发育4一、红细胞外期4二、红细胞内期4第二节 在蚊体内发育5一、配子生殖期5二、孢子增殖期5第二章 人体疟原虫形态7第一节 薄血膜中疟原虫形态7一、间日疟原虫7二、恶性疟原虫8三、三日疟原虫8四、卵形疟原虫9第二节 厚血膜中疟原虫形态11一、环状体11二、大滋养体11三、裂殖体11四、配子体12第三章 疟原虫镜检技术13第一节 血片的制作13一、所需设备13二、血膜的种类13三、采血部位及取血方法13四、涂制血膜14五、血膜染色前的处理14六、血片制作的注意事项14第二节 血片的染色16一、吉氏染色的原理16二、染色的方法16第三节 影响血片染色效果的因素18一、染料和溶剂的质量18二、染液的新旧18三、染液稀释后的使用时间19四、染液的稀释浓度19五、染色时间19六、染色用水19七、着色后染液的处理19第四节 疟原虫的镜检19一、镜检疟原虫应注意事项19二、疟原虫与其它物体的鉴别21三、形态鉴别的几个实际问题21第五节 疟原虫计数23一、半定量计数23二、厚血膜的疟原虫计数23三、薄血膜的疟原虫计数24第六节 血检质量控制24一、血片制作和染色质量判定标准24二、血片制作和染色质量规范25第七节 血检工作管理25第四章 生物显微镜的使用27第一节 使用方法27第二节 保养27附件1： 疟原虫镜检血片制作与显微镜使用参考标准29附件2-1：疟原虫图谱恶性疟原虫30附件2-2：疟原虫图谱间日疟原虫31附件2-3：疟原虫图谱卵形疟原虫32附件2-4：疟原虫图谱三日疟原虫33第一章 疟原虫生活史疟原虫（malaria parasite）寄生于人及多种哺乳动物，少数寄生于鸟类和爬行类动物，目前已知有130余种。疟原虫有严格的宿主选择性，仅极少数的种类可寄生在亲缘相近的宿主。疟原虫是人体疟疾的病原体。远在公元前的商殷时代，甲骨刻辞中就刻有一张床，床上的人在发抖的象形文字，表明3千多年前，我国已认识了疟疾的症状。在隋代诸病源候论所述，疟疾是由于遇到一种恶浊的气体，称之为“瘴气”所引起的。直至1880年法国人Laveran才在疟疾病人血液中发现疟原虫而认为是其病原体。疟原虫为单细胞真核生物，属原生动物亚界顶端复合物门、孢子纲、真球虫目、疟原虫科、疟原虫属。人体疟原虫有4种：间日疟原虫（P. vivax，P.v）、恶性疟原虫（P.Falciparum,P.f）、三日疟原虫（P.Malariae,P.m）和卵形疟原虫（P.Ovale,P.o），依次引起间日疟，恶性疟，三日疟和卵形疟。疟原虫的发育和繁殖，必须通过脊椎动物与昆虫媒介两个宿主，人体疟原虫的宿主是人和按蚊。疟原虫在人体分别寄生于肝实质细胞和血液中的红细胞内，在蚊体内则寄生于蚊胃，最后聚集于唾腺。4种人体疟原虫的生活史基本相同，包括在人体内的红细胞外期和红细胞内期以及在蚊体内的配子生殖和孢子增殖两个阶段（生活史见图1）。图1. 疟原虫生活史第一节 在人体内发育一、红细胞外期按蚊吸人血时，按蚊唾腺中的子孢子随唾液进入人体的末梢血液中，在30分钟内，随血流进入肝脏，在肝实质细胞内发育，进行裂体增殖，此时期称红细胞外期（简称红外期）或肝细胞期（简称肝期），此时期的疟原虫称肝期裂殖体。成熟肝期裂殖体直径为4560mm，内含数以万计的肝期裂殖子。肝期裂殖体成熟致使肝细胞破裂，裂殖子释入血液。不同种疟原虫的此期所需时间不同，从6天到12天不等。间日疟原虫的红外期裂体增殖较为复杂。目前认为间日疟原虫的子孢子在遗传学上具有两种不同的类型，即速发型子孢子和迟发型子孢子。速发型子孢子侵入肝细胞后开始红外期裂体增殖，释放出肝期裂殖子侵入红细胞，经裂体增殖引起临床发作。迟发型子孢子侵入肝细胞后暂不继续发育，处于休眠状态（休眠体），经过一段休眠期后，再发育成为成熟的红外期裂殖体，释放出肝期裂殖子侵入红细胞引起复发。恶性疟原虫和三日疟原虫无迟发型子孢子，因而恶性疟和三日疟也无复发现象。二、红细胞内期红外期裂殖子进入血液后，一部分被吞噬细胞所吞食，一部分在数分钟内侵入红细胞并开始发育，进行裂体增殖，这个时期称为红细胞内期(简称红内期)。裂殖子进入红细胞后发育成早期滋养体（亦称环状体）。以后逐渐发育，核增大，胞浆增多，并分解血红蛋白产生疟色素，其色泽、形状有种的差别。在吉氏染色标本上，被寄生的红细胞表面可见特异性斑点。此时的疟原虫称为晚期滋养体（亦称大滋养体，因其能呈阿米巴样运动，也称为阿米巴样体）。大滋养体继续发育，核开始分裂，逐渐发育成为成熟裂殖体。成熟裂殖体分裂的每个核被一份胞质包绕，核的数量因不同虫种而异，一般为832个，称为裂殖子。裂殖体成熟后，被寄生的红细胞破裂，释放出裂殖子。破裂的红细胞碎片、裂殖子和疟色素等进入血液，引起疟疾临床发作。一部分裂殖子被巨噬细胞吞食，一部分裂殖子再次侵入正常红细胞，开始新一轮的红内期发育，如此循环往复，称为裂体增殖周期。红内期发育成熟的时间，因不同虫种而异，间日疟原虫和卵形疟原虫为48小时，恶性疟原虫为3648小时，三日疟原虫为72小时，从而产生相应的间日发热和三日发热等不同发热周期。红细胞内的疟原虫经过数次裂体增殖后，部分侵入红细胞的裂殖子不再进行核分裂，而逐渐发育成为雌、雄配子体(或称大、小配子体)，这是疟原虫有性生殖的开始。成熟的雌、雄配子体被雌性按蚊吸入后，便在蚊胃内进行有性生殖。第二节 在蚊体内发育在按蚊叮吸携带有雌、雄配子体的人血时，红内期疟原虫进入蚊胃，但只有雌、雄配子体能在蚊体内发育和繁殖，其余各期均被消化。雌、雄配子体在蚊体内的发育和繁殖，包括配子生殖和孢子增殖两个期。一、配子生殖期在蚊胃内，雌配子体的核经过减数分裂，形成圆形不活动的雌配子。雄配子体的核分裂成48个，细胞浆伸出鞭毛状细丝，每1细胞核进入一条鞭毛状细丝内，形成雄配子。雄配子脱离母体后游近雌配子，雌、雄配子结合形成圆形的合子，并进一步发育成长形能蠕动的动合子。动合子穿过蚊胃壁的上皮细胞，停留于上皮细胞和弹性纤维膜之间，发育成卵囊。此时约为吸血后的第2472小时。二、孢子增殖期蚊胃壁上的卵囊可有数个、数十个或上百个。卵囊内核反复分裂，形成许多梭状子孢子。一个发育成熟的卵囊内可有1 000到10 000个子孢子。疟原虫在蚊体内发育时间的长短与温度和湿度有关，室温2426，相对湿度7580，是蚊体内疟原虫孢子增殖最适宜的条件。气温低于16或高于30时，发育变慢，并退化变性，直至死亡。成熟子孢子通过卵囊的微孔逸出或卵囊破裂后扩散入血腔，最后聚集于唾腺内。当含子孢子的雌蚊吸血时，子孢子随唾液进入人体，疟原虫开始其在人体内的发育过程。表1. 4种人体疟原虫的生物学特征恶性疟原虫间日疟原虫卵形疟原虫三日疟原虫红外期发育天数5891415休眠体无有有无红外期裂殖子数(个)30000100001500015000裂体增殖周期（小时）3648484872寄生红细胞特征幼红细胞Duffy阳性网织红细胞和幼红细胞网织红细胞和幼红细胞正常红细胞红细胞胀大无明显胀大略胀大无红细胞斑点茂氏点薛氏点薛氏点齐氏点疟色素黄褐色棕黄色棕黄色深褐色红内期裂殖子数(个)8261224 612612配子体新月/腊肠形圆形圆形圆形蚊内发育天数（27）108912141415卵囊内疟色素链状和条状皇冠羽毛状交叉线聚集于边缘第二章 人体疟原虫形态涂制于载玻片上的红细胞内期疟原虫，经吉氏染剂染色后，核呈红色，胞浆呈蓝色，疟色素呈黄褐色或深褐色，不着色部分为空泡。第一节 薄血膜中疟原虫形态薄血膜涂制均匀，每个红细胞平铺，互不重叠，迅速干燥后，疟原虫很快被固定，其结构清晰，便于观察形态和鉴别虫种。一、间日疟原虫(Plasmodium vivax) （一）环状体(Ring form)：亦称小滋养体。大小约占红细胞直径的1/3，核较大，胞浆较厚，中间有空泡，形态呈环状，故常称为环状体。很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2个核的情况。（二）大滋养体(Trophozoite)：呈阿米巴样，核一个，胞浆不规则，有时伸出伪足，含一个或几个空泡。该期胞浆中开始出现疟色素(Malarial pigment)，疟色素黄褐色，细小、杆状，散在分布。被寄生的红细胞明显胀大，褪色，常可见数量多、红色、细小的薛氏点(Schuffner，s dots)。较大的滋养体约是正常红细胞的1.5倍。（三）裂殖体(Schizont)：晚期大滋养体核开始分裂后即称为裂殖体。核经反复分裂，最后胞浆随之分裂，每一个核都被部分胞浆包裹，成为裂殖子(Merozoite)。早期的裂殖体称为未成熟裂殖体，晚期裂殖体称为成熟裂殖体，常充满胀大的红细胞。裂殖子较大，一般1224个，常见为1618个，排列不规则。疟色素常集中成团。（四）配子体(Gametocyte)：疟原虫经过数次裂体增殖后，部分裂殖子侵入红细胞中，核增大而不再分裂，胞浆增多而无伪足，最后发育成为圆形或卵圆形的个体，称为配子体，且有雌、雄(又称大、小)之分。雌(大)配子体圆形或卵圆形,核小而致密,深红色,常位于虫体一侧,胞浆深蓝色。雄(小)配子体圆形,核大而疏松,淡红色,常位于虫体中央,胞浆浅蓝色或淡红色。成熟配子体一般大于正常红细胞1.52倍,色素粗大,分布均匀。成熟雌配子体与晚期大滋养体的形态很相似,二者形态的鉴别见表2。表2 成熟雌配子体与晚期大滋养体形态鉴别雌配子体晚期大滋养体大小几乎充满被寄生的红细胞不超过被寄生的红细胞核一个,较大且致密,周围有不染色带一个,带状,周围无明显的不染色带胞质边缘清楚,不含空泡边缘不整齐,略有空泡疟色素颗粒较多、粗大,均匀分布颗粒较少、细小,分布不均匀或成团二、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)（一）环状体：恶性疟原虫的环状体在4种人体疟原虫中体积最小，约占红细胞直径的1/6，核小，胞浆纤细。常见一个红细胞内可寄生2个或几个环状体，一个环状体中可有2个核。环状体常位于红细胞的边缘。（二）大滋养体：大滋养体常呈圆形，体小坚实，一般空泡不显著，疟色素金黄色，颗粒细小，结成团块后，呈黑褐色。被寄生的红细胞大小正常、颜色正常或稍紫，可见几粒或十几粒、大小不一、红色、粗大的茂氏点(Maurer，s dots)。（三）裂殖体：成熟裂殖体小于正常红细胞，含裂殖子826个，常为818个，排列不规则，疟色素结成团块，黑褐色。（四）配子体：雌配子体呈新月形，两端尖锐，核小而致密，深红色，位于中央，胞浆深蓝色，疟色素密集分布于核的周围。雄配子体呈腊肠形，两端钝圆，核大而疏松，淡红色，位于中央，胞浆浅蓝色或淡红色，疟色素松散分布于核的周围。幼稚配子体在外周血液不易被发现，一般呈梭状，两端尖锐，核常位于一端，疟色素遍布于胞浆中。三、三日疟原虫(Plasmodium malariae )（一）环状体：环状体略小于间日疟原虫，核较大，胞浆粗厚，有时可见疟色素。（二）大滋养体：大滋养体常呈带状，核常呈长条状，胞浆坚实，一般不含空泡，疟色素颗粒粗大，深褐色，常沿边缘分布。被寄生的红细胞颜色正常，大小正常或略有缩小，偶见浅紫色微细的齐氏点(Ziemann，s dots)，其数少于薛氏点而多于茂氏点。（三）裂殖体：成熟裂殖体小于正常红细胞，含裂殖子612个，常为8个，形成菊花状，疟色素常位于中央，渐趋集中，分布不匀。（四）配子体：雌、雄配子体形状与间日疟原虫相似，但虫体小于正常红细胞，疟色素颗粒粗大。四、卵形疟原虫(Plasmodium Ovale)（一）环状体：环状体核较大，胞浆较粗厚。（二）大滋养体：大滋养体胞浆坚实，空泡不显著，常呈圆形，极少呈带状，疟色素棕黄色，颗粒粗大。被寄生的红细胞大小正常或稍胀大，部分红细胞变为卵圆形或边缘呈伞矢状，可见到较多斑点粗大的薛氏点，且比间日疟出现的早，在环状体期已可见到。（三）裂殖体：圆而坚实，约占红细胞的3/4，一般不超过正常红细胞大小。成熟裂子体含裂殖子612个，常为8个。（四）配子体：雌、雄配子体形状与间日疟原虫相似，大小一般不超过正常的红细胞。薄血膜中4种疟原虫形态鉴别见表3。表3 薄血膜中4种疟原虫形态鉴别(吉氏染色)间日疟原虫恶性疟原虫三日疟原虫卵形疟原虫被寄生红细胞大小形状颜色斑点胀大褪色薛氏点出现稍晚,红色,细小数多正常正常或稍紫茂氏点红色,粗大,数少正常或缩小正常齐氏点淡紫色,微细正常或稍胀大.卵圆形或边缘呈伞矢状。褪色薛氏点出现较早,粗大,数多.环状体大小核胞浆疟色素较大,约占红细胞直径的1/31个较厚无较小,约占红细胞直径的1/6。1或2个纤细无中等1个较粗厚偶见细小褐色颗粒中等1个较粗厚无大滋养体大小核胞浆疟色素较大1个阿米巴样,常含空泡黄褐色,细小,杆状,散在分布较小1和2个圆形,空泡不显著金黄色,细小,结成团块后,呈黑褐色较小1个带状,空泡不显著深褐色,粗大,沿边缘分布较小1个圆形,空泡不显著棕黄色,较粗大未成熟裂殖体大小核胞浆疟色素较大2个以上圆形或不规则,空泡消失黄褐色,分布不匀较小2个以上圆形,空泡消失黑褐色,团块状较小2个以上圆形,空泡消失深褐色,分布不匀较小2个以上圆形或卵园形,空泡消失棕黄色,分布不匀成熟裂殖体大小裂殖子疟色素大于正常红细胞1224个,常为1618个,排列不规则黄褐色,常聚集一侧小于正常红细胞826个,常为818个,排列不规则黑褐色团块小于正常红细胞612个,常为8个,常排列如菊花状深褐色,常聚集中央 小于正常红细胞612个,常为8个,排列不规则棕黄色,常聚集中央或一侧 雌配子体大小形状核胞浆疟色素大于正常红细胞圆形1个,较小,致密深红色,位于一侧深蓝色黄褐色均匀散在较大新月形,两端尖锐一个,较小, 深红色,位于中央深蓝色黑褐色,紧密分布于核周围小于正常红细胞圆形一个,较小, 深红色,位于一侧深蓝色深褐色,均匀散在小于正常红细胞圆形一个,较小, 深红色,位于一侧深蓝色棕黄色, 散在雄配子体大小形状核胞浆疟色素大于正常红细胞圆形1个,较大,淡红色,位于中央浅蓝色黄褐色,均匀散在较大腊肠形,两端钝园1个,较大,淡红色,位于中央浅蓝色或淡红色黑褐色,松散分布于核周围小于正常红细胞圆形1个,较大,淡红色,位于中央浅蓝色深褐色,均匀散在小于正常红细胞圆形1个,较大,淡红色,位于中央浅蓝色棕黄色, 散在 第二节 厚血膜中疟原虫形态在厚血膜上细胞重叠，加之血膜干燥缓慢及溶血等因素，导致虫体皱缩，空泡消失，胞浆变形，因此，4种人体疟原虫在厚血膜上的形态与薄血膜相比有较大改变。一、环状体 环状体因空泡消失，胞浆断裂而呈现各种形状，镜检时常见“！”、“，”、“飞鸟”、“v”形和“鸟眼”状等。（一）间日疟疟原虫：环状体大于恶性疟环状体，核较大，胞浆较厚，呈“！”或“，”等。常伴有其它各期疟原虫。（二）恶性疟疟原虫：体积较小，胞浆纤细，常呈“!”“飞鸟”、“v”形或“断环”等。（三）三日疟疟原虫：环状体大于恶性疟原虫而略小于间日疟原虫，胞浆较粗厚，常呈环状或“鸟眼”等。有时可见色素。（四）卵形疟疟原虫：环状体与间日疟原虫相似，胞浆致密，核较大。二、大滋养体（一）间日疟疟原虫：大滋养体活泼，空泡大，故形态变化较大，可缩成各种形态，常见的胞浆缩为圆形，核和疟色素均被包在中间，着色深，只能看到深蓝色的胞浆和黄褐色的疟色素折光，核模糊不清。有些胞浆皱缩断裂成几个团块，大小不一，互相不连接，核位于胞浆中间或外侧，疟色素分布不均。有些则仅看见胞浆和疟色素。（二）恶性疟疟原虫：几乎与薄血膜一样，常呈圆形，体小坚实，疟色素细小，金黄色，结成团块后，呈黑褐色。（三）三日疟疟原虫：常呈圆形或卵圆形，带状者罕见。由于它的胞浆坚实，疟色素颗粒粗大，深褐色，数量较多，以致整个原虫呈黄绿色，核不清楚。（四）卵形疟疟原虫：与间日疟原虫相似。三、裂殖体 4种疟原虫未成熟或成熟裂殖体，除虫体略有缩小而着色较深外，几乎与薄血膜一样。间日疟疟原虫和卵形疟疟原虫裂殖体较大，而恶性疟疟原虫和三日疟疟原虫均较小。三日疟疟原虫裂殖子较大，间日疟疟原虫和卵形疟疟原虫次之，恶性疟疟原虫较小。四、配子体 间日疟、卵形疟和三日疟疟原虫的配子体相似，均呈圆形，但前者比后者大。恶性疟疟原虫配子体呈新月形或腊肠形，常见其边缘上附着一小块皱缩的红细胞，疟色素散在核周，其外为一圈胞浆，还可见配子体的胞浆部分或全部消失，只留下核和疟色素，或核和胞浆均消失，只留下疟色素。厚血膜中4种疟原虫形态鉴别见表4。表4 厚血膜中4种疟原虫形态鉴别(吉氏染色)间日疟原虫恶性疟原虫三日疟原虫卵形疟原虫环状体较大。核1个，较大。胞浆较厚，常呈！或，状较小。核12个,较小。胞浆纤细,常呈！、飞鸟、v和断环状中等。核1个,较大。胞浆粗厚。常呈 环状或鸟眼状大小与间日疟原虫相似,胞浆致密,核较大大滋养体较大。呈阿米巴样,形状不规则。核位于胞浆中或外边,胞浆常缩成圆形或断裂成数块。疟色素分布不匀较小。常呈圆形,疟色素细小或结成12个团块中等。常呈圆形,疟色素粗大大小与间日疟原虫相似,胞桨呈深蓝色,核较大裂殖体较大。裂殖子1224个。裂殖子较大较小。裂殖子826个。裂殖子较小较小。裂殖子612个。裂殖子大于间日疟原虫裂殖子大小与间日疟原虫相似,裂殖子614个,核较大配子体较大。圆形,疟色素粗大。雌配子体较大,核小,胞质深蓝色。雄配子体较小,核大,胞浆浅蓝色雌配子体新月形,雄配子体腊肠形与间日疟原虫相似,但较小。疟色素较粗大卵圆形,大小与间日疟原虫相似, 雌配子体核致密,偏于一侧,雄配子体核疏松疟色素黄褐色,细小,杆状或结成粗大颗粒,分布不匀黄褐色,颗粒细小,结成团块后呈黑褐色。配子体疟色素粗大,分布核周围有时环状体可见疟色素。深褐色较粗大,沿边分布色素颗粒较大,呈深棕色,分布弥散被寄生红细胞常见红细胞“影子”和薛氏点可见红细胞“影子”和茂氏点可见红细胞“影子”环状体时即可见薛氏点其他常可查到各阶段的疟原虫一般仅见环状体和配子体。危重患者可见到大滋养体和裂殖体常可查到各阶段疟原虫常可查到各阶段疟原虫第三章 疟原虫镜检技术血涂片显微镜检查，是疟疾诊断和虫种鉴别的主要方法。发热病人血涂片显微镜检查，是疟疾控制和监测的重要手段。第一节 血片的制作一、所需设备（一）载玻片：玻片在使用前应清洗。新玻片应浸入有液态洗涤剂的清水中1020分钟，用干净棉巾逐个擦拭，再放入盛有清水的容器中换水34次，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中12天，或浸泡于煮沸的5%肥皂水(也可用适量的洗衣粉)12小时，逐个擦去玻片上的旧血膜痕迹，用清水漂洗34次，再将玻片擦干和擦亮。洗净的玻片每2050张用白纸包好后放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。（二）采血针：使用一次性的采血针。（三）75%乙醇棉球：用于采血前后的消毒。二、血膜的种类常用的血涂片有两种：一种是借推片将血液薄薄地涂在载玻片上，使每个血细胞平铺，称薄血膜，因薄血膜血液干燥快，原虫形态极少变形，多用于观察疟原虫形态与鉴别虫种；另一种是把较多的血液涂成圆形，血膜中血细胞重叠，原虫较为集中，称为厚血膜，厚血膜涂布面积小，阳性检出率高，据统计厚血膜的镜检效率比薄血膜提高6倍。现采用的是一张载玻片上同时做厚、薄血膜各一个，检查是查厚血膜，薄血膜供编号和鉴别虫种用。三、采血部位及取血方法采血部位多在手指末端，也可在耳垂采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75%乙醇棉球消毒取血部位，待干后，以左手拇指和食指夹住被检者手指尖稍下方或轻轻捻转耳垂边缘，右手持消毒刺针，迅速刺入取血部位12毫米深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。四、涂制血膜取玻片2张，1张做载片，1张做推片（具有光滑边缘），用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液45l（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液11.5l(小米粒大小)。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右，由里向外划圈涂成直径为0.81cm的圆形厚血膜（厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到510个白细胞为宜）。用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持2535角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载片之间夹角大小以及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制成的薄血膜应在玻片上形成一层平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。标准血膜的位置如图2。五、血膜染色前的处理待血膜自然干燥后，用铅笔将受检者号码写在薄血膜上，然后用甲醇固定薄血膜并对厚血膜进行溶血处理。未处理血膜的放置时间夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定且不能溶血，影响镜检。六、血片制作的注意事项刚涂制的血片应平放在标本盒内。如果没有标本盒，应用有盖的纸盒、方盘等盛装血片，防止灰沙污染、苍蝇、蟑螂和其它吸血昆虫吮吸血膜。涂制的血膜应让其自然干燥，切勿用火烤或太阳晒致血红蛋白凝固，在炎热的天气放置时间更不宜过长。新的木制标本盒需放置一段时间，让木醇挥发后才能使用以免厚血膜血红蛋白被固定而影响染色效果。必要时可先将薄血膜用甲醇固定后放入冰箱（45）保存。未干的血膜，绝对不要倾斜放置，避免厚血膜中血细胞沉积于一边，造成血膜厚薄不均，厚处不易脱血和着色而影响检查结果，血膜干燥后还应避免受潮。别外，有时由于某些原因未能及时染色时，可在厚血膜干燥后，先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，再用清水溶掉厚血膜上的血红蛋白，凉干后包扎好待以后染色。已洁净的玻片，应避免用手指接触玻片的上下两面，以防手上油垢污染玻面，造成染色过程血膜的脱落。因此在制片和染色过程中，要养成手指尖持玻片侧缘的习惯。标准血膜示意图图2. 标准血膜示意图第二节 血片的染色目前使用的血片染色液为吉氏染液，它被认为是当前较优良的血膜染剂,尤其染厚血膜和大量血片染色时,吉氏染液较为稳定,所染的血膜保存时间较长。另外，吉氏染液经配制后，即使在炎热的天气中，亦可经久不变，染色易于掌握。一、吉氏染色的原理染色的原理：是染料与被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学作用。细胞和原虫主要是由不同的蛋白质类氨基酸构成的。各种细胞及其不同部分则含有互不相同的氨基（NH2）和羧基（COOH）。在游离时，NH2获得一个H成为带阳电的离子（NH3+）；而（COOH）失掉一个H成为带阴电的离子（COO-）。伊红的有色基团为阴离子，是一种酸性染料，染色用的是它的水溶性纳盐。溶于水中时离解为钠的阳离子和伊红阴离子，它可和带阳电的蛋白质（NH3+）如遇血红蛋白或嗜酸伊红白细胞中的颗粒时，即可结合而成不易溶于水的沉淀，使此类蛋白质染成红色。天青是硷性染剂，又具有媒染作用，它不但能与疟原虫、淋巴细胞和大单核细胞的细胞浆及嗜硷性白细胞等蛋白质结合，使这些结构染成蓝色，而且能使疟原虫和白细胞的核等原来只能染上极淡紫红色的结构染上显著的酸性染料伊红，这样，就使白细胞粗大的核染成显著的既蓝又红的紫蓝色，而较小的疟原虫核和淋巴细胞中的颗粒染成紫红色。甲醇是吉氏染色粉的良好溶剂，有利于细胞蛋白质选择地吸附其中有色离子而着色。甲醇又是良好的固定剂，具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态。当细胞发生凝固时，蛋白质被沉淀为粒状、网状等结构，增加了细胞表面积，提高了对染料的吸附作用，增强染色效果。二、染色的方法（一）吉氏(Giemsa)染液配制吉氏粉 5g甘 油 250ml甲 醇 250ml 将吉姆萨粉5g置于研钵中，加入少量甘油小心充分研磨，溶解缓慢，边加边磨，至250ml甘油加完研磨均匀为止，然后倒入500ml的容量瓶中。每次加入少量甲醇至研钵中，多次洗涤研钵中的残留液，洗净为止，洗液均并入容量瓶中，再加入其余部分甲醇，塞紧瓶塞，充分摇匀，室温放置。每天用力摇动此溶液5分钟，3天后即可储存备用。（二）缓冲液配制溶液I：无水磷酸氢二钠 9.50g蒸馏水 加至1000ml溶液II：磷酸二氢钾 9.07g蒸馏水 加至1000ml将上述两种磷酸盐分别置于1000ml容量瓶中，分别加入部分蒸馏水摇匀，使溶解后再加入蒸馏水稀释至1000ml，充分摇匀。将配好的溶液I和溶液II分别装入玻璃瓶中塞紧备用。临用时，根据选用pH的不同，按下表用量，再配制成不同pH的缓冲溶液用于染液的稀释和染色后的冲洗。根据选用的不同pH，将上述表中溶液I和溶液的相应用量倒入1000ml容量瓶中，加入部分蒸馏水，混合摇匀后，再加入蒸馏水稀释至1000ml的刻度，塞紧瓶塞反复摇匀后，即配制成不同pH的缓冲溶液。表5. 配制不同pH缓冲溶液的用量表pH溶液I用量（ml）溶液II用量（ml）稀释成的总ml数6.6376310006.8495110007.0633710007.2732710007.481191000（三）染色用水：常用的染液的稀释用水和染色的冲洗用水，是中性的缓冲液，也可用中性蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。在没有缓冲液、蒸馏水的情况下，也可用井水、河水、泉水或雨水。因稀释和冲洗用水的pH在7.07.2时，染色的效果最佳。因此，最好选用配制的缓冲液，以取得较好的染色效果。（四）染色方法1.单张血片染色：取pH7.07.2缓冲液或蒸馏水2ml，加入吉氏染液2滴，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色2030分钟，然后水洗、晾干。2.成批血片染色：将血膜片朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2吉氏染液(2ml吉氏原液加入pH7.07.2缓冲液或蒸馏水至100ml，摇匀)，浸没厚、薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗23次，然后取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。染色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈兰色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色，疟原虫的核呈红色。第三节 影响血片染色效果的因素血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响。一、染料和溶剂的质量染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此，必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。二、染液的新旧新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈偏碱性。染液存放时间越久，染色力越强，尤以吉氏染液更甚。通常在染液配制12周后才使用。盛装染液的瓶子应加塞盖密封以防吸潮而影响染液质量。三、染液稀释后的使用时间吉氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，稀释的染液应当时使用，一般在半小时内染色力最强。四、染液的稀释浓度染液的浓度高其着色就快而深，因而使疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱，染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。一定要试染以求得好的浓度和效果。五、染色时间染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此，染色时间应根据染液的质量新旧、稀释浓度和气温而适当增减。六、染色用水染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择pH7.07.2的缓冲液及清洁水，通常使用的是新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水、以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲液和蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝(偏碱)或偏红(偏酸)时，可用与之相反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。七、着色后不要直接将染液倒掉着色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层浮渣溢出，并轻轻冲洗，避免染液色素颗粒沾污血膜。第四节 疟原虫的镜检一、镜检疟原虫应注意的事项（一）镜检疟原虫时，先对正常厚、薄血膜中各种血细胞（红细胞、中性细胞、酸性细胞、硷性细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板）的形态、内部结构和染色性质加以识别。这样在阳性血膜中才能及时正确诊断并判定其疟原虫的种、期。（二）应掌握疟原虫各个发育阶段的基本特点，比较厚、薄血膜中疟原虫形态的变化，注意识别厚膜中一些变化较大而不典型的疟原虫。镜检疟原虫时一般查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时的参考和血片编号之用。（三）镜检时，在厚血膜上先滴香柏油一滴，用油镜（100）配合低倍目镜（56）镜检。当发现疑难问题时，可调换10目镜进行观察。（四）镜检时应从厚血膜上沿开始，从上而下，从左至右，再由右至左，这样往返一行接一行，一个视野接一个视野顺序地查完整个血膜。（五）在厚膜中必须根据疟原虫的核、胞浆、疟色素三个条件鉴别是否是疟原虫及何种虫种。在一般情况下，具备三条中的二条也能给以判定。有时因染色较浅，看不见原虫的核和胞浆，只见到典型的疟色素也可断定。也有仅见到核和少许胞浆，或者因染液过偏酸性连胞浆也看不清楚，同时又看不见色素，但是只要对被染血膜的颜色、红细胞的残影、疟原虫所处的背景加以综合分析，仍可正确做出判断。（六）看完血片后，若为阳性，应立即按血片编号登记原虫的种、期，以防差错。为检查后记录结果方便起见，对疟原虫的种、期可使用英文字母缩写作为代号：间日疟=P.v (P. vivax)恶性疟=P.f (P.falciparum)三日疟=P.m (P.malarae) 卵形疟=P.o (P.ovale)环状体=R (Ring form)大滋养体=T (trophozoite)裂殖体=S (Schizont)配子体=G (Gametocyte)二、疟原虫与其它物体的鉴别厚血膜可受血片制作、染液及酸硷度的影响，有的血片中只见到小滋养体的核而不见胞浆；只看到疟色素而无其它结构；或者只见胞浆断裂的残块。这样，它与采血时沾污的污物、细菌；涂片时白细胞破裂后散出的颗粒、碎片，幼稚红细胞的残骸；染色过程中所落在血膜上的灰尘、真菌、孢子、水中原虫等，易被误诊为疟原虫，应注意鉴别。（一）白细胞残骸和幼稚红细胞残骸：白细胞破裂后散出的颗粒，易误诊为环状体的核，但看不到胞浆；白细胞残骸和幼稚红细胞残骸常为兰色，与疟原虫的胞浆相似，有时与其它的红点或与血小板巧合在一起，而容易误认为疟原虫。鉴别时如形同大滋养体，可根据疟色素的特点来鉴别；如形似小滋养体，可依据虫体大小、折光是否均匀、核与胞浆是否在同一平面，其它视野内有无疟原虫，仔细分析方可判定。（二）灰尘和染色液的色素沉着：若灰尘和染色液的色素沉着在血膜的表面上时，易被误认为是疟色素，可依据其颗粒形状、大小、色泽，及有无核与胞浆的结构来鉴别。也可转动显微镜的微螺旋，看其是否在同一平面上，若不在同一平面者一般不是疟原虫。（三）细菌：细菌尤其是球菌在厚血膜中常被染成红色小点，与疟原虫的核相似，最易混淆。但球菌形体较大，边缘光滑，且与红细胞不在同一平面。（四）水中原虫：水中原虫有时也可看到核、胞浆和空泡，似间日疟原虫大滋养体，但无疟色素，而空泡多如网状，可与疟原虫相区别。（五）植物种子：这些物体有很清晰的厚薄一致的边界，染色较深，无疟色素，也看不到核，且有柄脱落时的痕迹。三、形态鉴别的几个实际问题（一）各种疟原虫各期形态鉴别要领1.被寄生的红细胞形态大小及染色深浅度（是否褪色）。2.胞浆色彩及其浓淡，结构疏密，有否空泡及不着色带，体积大小。3.色素斑点（薛氏点、茂氏点、齐氏点）。4.查其他各期形态是否存在作参考。5.色素颗粒的形态、颜色、排列。尤其是厚血膜更为重要，否则在形态鉴别上会混淆。（二）疟色素颗粒鉴别要领1.与原虫同在一水平面上。2.有立体感。3.色泽特殊，只有单色（色泽与背景色有关，须将视野放暗）。4.形状如米粒状、沙粒状、颗粒状、短杆状，细粒可凝聚成堆。（三）厚血膜原虫形态的差异（以间日疟为例）环状体：空泡消失，胞浆收缩。大滋养体：虫体变小，不太活动，空泡基本消失，胞浆可断裂成块，核变化小，色素颗粒有成堆现象。裂殖体：体积变小，裂殖子排列不规则，互相重叠多，挤在一起，色素颗粒成堆较多。各种疟原虫的色素颗粒鉴别见表。配子体：体积变小，胞浆收缩均匀，不着色带不完整或不见色素颗粒，差异不大。表6. 疟原虫各期形态的疟色素颗粒鉴别表原虫种类间日疟恶性疟三日疟环状体无无细小，黑褐色。大滋养体细小杆状，黄褐色。细沙状，金黄色，集团块状后呈黑褐色。粗大，沙粒状，深褐色，数目极少。裂殖前期细杆状，黄褐色，常呈疏密不匀分布。细小，黑褐色，呈不整齐的团块。粗大，深褐色，或聚成团块。裂殖体黄褐色，常集聚于一侧。黑褐色，集中于中央或一侧。深褐色，位于中央。小配子体黄褐色，杆状，散在。黑褐色，团块，围于核周，较分散。深褐色颗粒，散在。大配子体黄褐色，数目多，散在。黑褐色，团块状，围于核周，较紧密。深褐色颗粒，散在，数目较多。（四）裂殖子与血小板的形态鉴别血