植物生理学中各项生理指标的测定方法.doc

一.实验内容实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯) 实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂： 考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素 实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0） 30% H2O2实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASAPOD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTANa2 PBS (pH7.0) 30%H2O实验6： ASA(维生素C)含量测定偏磷酸 95%乙醇 磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl36H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO42H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸 甲苯 茚三酮 冰乙酸 85%磷酸 试验9：叶绿素含量测定。 80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/LEDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8） 4冷冻15000g离心20分钟上清液即为酶液（5下保存一两天内备用，中短期用-20保存）2ASA . GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液4冷冻14000g离心10分钟上清液即为母液（5下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBS EDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法： Na2HPO412H2O NaH2PO42H2O取 71.64g，蒸馏水定容至1L，取 31.21g定容至1L，放置4冰箱备用PH=7.8 取 91.5ml+ 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三实验步骤实验1：MDA含量测定 1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液摇匀95加热15分钟快速冷却3000g离心15分钟 取上清测定 OD532，OD600，OD450值 按公式求 MDA浓度=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450 (mol/L)可溶性糖浓度=11.71OD450 (mmol/L)最后计算 MDA含量（mol/g FW）= 4（MDA浓度x）10-3/0.1同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4（可溶性糖浓度）10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。2.硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代巴比妥酸（溶于20%的三氯乙酸）溶液。实验2：可溶性蛋白含量（参照Bradford方法测定），以BSA作为标准蛋白（牛血清蛋白）2.1所需试剂及配制：牛血清蛋白（BSA），考马斯亮蓝G-250 ，95%乙醇，85%磷酸考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%的磷酸，最后蒸馏水定容到1L，混匀，放置过夜，过滤后贮放在棕色瓶中，常温下可放置一个月。标准曲线制作： 标准溶液配制：称取10mg牛血清蛋白标准液，溶于蒸馏水，定容至100ml，制成100g/ml的标准液，4下保存备用。（必须是牛血清蛋白向水中溶解，不能颠倒） 取6支具塞试管（10ml），按下表配制含0-100g/ml的牛血清蛋白液各1ml（调零管） 123456蛋白标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20蛋白含量（g）020406080100 各试管加入5ml G-250染色剂，翻转混合，放置2分钟，595nm比色，绘制过原点标准曲线（方程式）。（相关系数要两个9以上）2.2步骤：标准曲线（参考邹琦）（595nm比色）注意：制作通过原点的标准曲线，以含0g蛋白质液调零取0.1g样品，加5ml蒸馏水提取，5000g离心10分钟，取上清1ml测定1ml样液+5ml G-250液盖塞翻转混合数次，最后595nm比色，直接从标准曲线读含量。（此方法反应十分迅速，2分钟即达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定）实验3：SOD酶活性3.1步骤：1. 取50l酶液加入2ml 39m mol/L 甲硫氨酸（Met）2ml 0.225m mol/L NBT , （氮蓝四唑）1ml 0.6m mol/L EDTA-Na2（ 可以配制在一个试剂瓶里）1ml 0.012m mol/L 核黄素，摇匀。（现配现用）2（人工培养箱内）4000L日光灯下放置30分钟后，温度控制在30 ，于暗处终止反应。（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔5min转过90度，转四次。对照（不加酶液）每次至少对称地放3支，调零的不照光和不加酶液）3560nm处测吸光值，酶活性以抑制NBT光反应50%为一个酶活单位表示。（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后，一次加入5ml，然后依次加入核黄素和酶液，以不加酶液的照光管为对照。）均以50mmol/LPBS配置PH=7.83.2所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） 39mmol/L 1.1638g/200mlNBT 0.225mmol/L (0.01840克)/ 100ml 0.0368g/200mlEDTA-Na2 0.6mmol/L 0.0223g/100ml核黄素 0.012mmol/L 0.0045g/L或 0.0045g/100ml 用时稀释10倍各试剂溶液均在用前配置，配置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。试验进行时一次性加5ml的反应混合液配置方法： Met + NBT + EDTA-Na2200mll+200ml+100mlSOD酶测定时，酶液量50l偏少，改为100l为佳，另外反应时间30分钟过长，改为20分钟适合。SOD活性（酶单位u/gFW）=(A0-A1)*V / A0*0.5*FW*aA0-对照照光管光吸收值； A1-样品管光吸收值。V-样液总体积（ml）5ml FW-鲜重（g） 1g a-测定用样品的量（ml） 0.1ml实验4：CAT活性（过氧化氢酶）4.1所需试剂： PBS（PH=7.0）50mmol/L （61份50mmol/l Na2HPO4, 39份50mmol/l NaH2PO4）15mmol/L H2O2(以30% H2O2配 )（取85.2L 30% H2O2，以50mmol/L PBS(PH 7.0)定容至100ml） 4.2步骤：1. 3ml 50mmol/L PBS (PH7.0)加入50l酶液（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）再加入5l 15 mmol/L H2O2 摇匀（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。2240nm处作时间扫描（每0.5分钟测1次，共测3分钟）3CAT活性以每分钟消耗1mol的H2O2为一个酶活单位。活性计算改动：（以每分钟OD值减少0.01为一个酶活单位u）（2005和2006年均是按OD值减少0.01算的）（以每分钟OD值减少0.1为一个酶活单位u）注意：以PBS作空白调零50mmol/L实验5：APX活性(抗坏血酸过氧化物酶)（即ASAPOD活性）5.1所需试剂：ASA（分子量167.12） 0.3m mol=0.052836 (g)(乙=胺四乙酸=钠)EDTANa2 (以PBS配成0.1m mol/L=0.0372 (g)/L)50m mol/L PBS (pH7.0)9m mol/L H2O2 (以30%H2O2配制)(51l 30%H2O2定容至100ml)计算为：K1=2.8，K2=3，K3=-1，K4=100可得到总取样（5ml酶液或1g样）的最终活性。酶活性单位为mol/g (鲜重)min以后APX活性测定可参考沈文飚：抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨3 ml反应液中含50 mmol/L PBS, pH7. 0, 0. 1 mmol/L EDTA（或EDTANa2），0. 1 mmol/L H2O2，0. 5(或0.3) mmol/L AsA，最后加入适量酶液（20、50、100ul均可）启动反应，连续记录测定室温下290 nm吸收值的变化。以不加H2O2作为对照，H2O2本身对AsA的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽略不计。室温下每分钟氧化1 umolAsA的酶量作为一个酶活性单位(U)(吸光系数为2. 8 mmol/L cm)5.2步骤：1.配反应液（50m mol/L PBS(pH7.0)，内含0.1m mol/L EDTANa2，含0.3m mol/L ASA）2.样品池加入3ml反应液，加入50l酶液，最后加入5l 9mmol/L H2O2 (盖上比色杯的盖子摇匀，23次)在290nm处作时间扫描，每10秒测一次，共测30秒。（注意：在测定中消光值应该是不断减小的）3. 根据OD290值变化，计算单位时间内AsA消耗量，（ASA氧化消耗量按消光系数2.8mmol/Lcm。），酶活性以单位时间每消耗1mol的ASA为一个酶活单位，最后计算样品的APX活性（单位为：U/g (鲜重)min）。（活性计算改动）根据OD290值变化，计算单位时间内AsA减少量（ASA氧化量按消光系2.8mmol/Lcm），并计算样品APX终活性。酶活性单位为mol/g (鲜重)min实验6 ASA含量测定6.1步骤：1.取样品母液0.2ml, 1.4ml，75mmol/l NaH2PO4 溶液（pH值7.4） (2.34g NaH2PO42H2O 定容至200ml，用NaOH将pH调至7.4)混合；（75mmol/l NaH2PO4 溶液亦可用150mmol/l NaH2PO4 溶液稀释1倍得到）2.依次加入（1）10%偏磷酸（26.3158g 38%偏磷酸定容至100ml）0.4ml;（2）44%磷酸（26ml 85%磷酸 +41ml 蒸馏水）0.4ml; ( 3) 4% 2,2-二联吡啶 （称取4.0 g 2,2-二联吡啶用70%酒精定容至100ml ）0.4ml;70%酒精配制（95%乙醇70份重量+蒸馏水25份重量）3% FeCl3 0.2ml( 称取5.0g FeCl36H2O 定容至100ml)，摇匀，于37保温1.0h（5）测525nm波长下的光吸收值4.以标准曲线方程计算ASA含量6.2标准曲线的制作：（1）称取10mg ASA分析纯，以5%偏磷酸定容至100ml,成100微克/毫升的标准液；（2）按下表取8支试管，按照表中的程序加液试管编号12345678标准液（ml） 00.020.040.060.080.100.120.145%偏磷酸（ml）0.200.180.160.140.120.100.080.06ASA含量（微克）02468101214按前面步骤1、2所述依次加入各反应液，最后测525nm波长下的光吸收值，作过原点标准曲线，求线性方程。实验7：GSH含量测定 7.1步骤：1.取样品母液0.2ml，加入150 mmol/L NaH2PO4溶液（pH7.7）（11.70g NaH2PO42H2O定容至500ml 用氢氧化钠调pH至7.7）2.6ml2.混匀再加入0.2ml DTNB溶液（=硫代硝基苯甲酸DTNB75.3mg溶于30ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液 pH6.8）摇匀。实际配置时，称75.32=150.6mg ，即0.1506g DTNB溶于60ml PBS中3. 在30保温5分钟，测定412nm波长下的光吸收值。【有些文献（如龚吉蕊、於丙军）方法同样用DTNB显色，都是在常温下显色30分钟 因此可将反应时间适当延长至10分钟】7.2根据标准曲线（GSH）方程，计算GSH含量。 标准曲线制作：1.称取100mg GSH分析纯，以5%偏磷酸定容至100ml，成1mg/ml即1000ug/ml的标准液。2.参照实验6标液方法。试管编号12345678标准液（ml） 00.020.040.060.080.100.120.145%偏磷酸（ml）0.200.180.160.140.120.100.080.06GSH(微克）02468101214正确GSH含量（微克）0204060801001201403.以GSH含量为0的溶液调零，制作过原点标准曲线（及方程）所需试剂：NaH2PO4 （150m mol/L）称23.41g NaH2PO42H2O定容至1L（或称5.85定容至250ml）DTNB（二硫代硝基苯甲酸）0.1mol/L PBS (PH6.8)（参照邹琦的书）实验8：脯氨酸测定8.1步骤：1.取0.5g叶片，用5ml 3%磺基水扬酸溶液提取，匀浆液在沸水浴浸提10分钟，冷却后，以3000g离心10分钟，上清液待测。2.取2ml待测液，加入2ml蒸馏水，再加入2ml冰乙酸和4ml 2.5%茚三酮溶液，置沸水溶显色60min，冷却后，加入4ml甲苯充分振荡提取红色物后，静置后，取甲苯相（将移液枪的量程调至3.0ml 吸取甲苯相，注意不要将枪伸到水相中。）测定520nm，波长处的吸收值，依据标准曲线计算含量。8.2标准曲线制作：1.标准液配制；准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100g/ml，再取10 ml此液，蒸馏水定容至100ml，即为10gml-1的脯氨酸标准液。（脯氨酸标准液最好现用现配，放在冰箱也易变性）2.取7支20ml具塞试