柯萨奇病毒的RT-PCR实验室诊断.ppt

柯萨奇病毒的RT PCR实验室诊断 属于小 病毒科肠道病毒属 最易在灵长类动物细胞中生长 病毒分为 两组 柯萨奇病毒 组有 个血清型 柯萨奇病毒 组有 个血清型 柯萨奇病毒 单股正链RNA 全长大约7 4Kb 病毒直径为25 30nm 球形 无包膜 病毒衣壳由VP1 VP4等构成 呈20面体立体对称 柯萨奇病毒 Coxsackievirus CV 的诊断方法 病毒分离 动物接种操作烦琐 成功率低 影响诊断的敏感性 ELISA法检测患者血清中相应的特异性IgM IgG抗体 但不能获得有关病毒更多的信息 RT PCR法既可以通过检测病人样本中的病毒RNA来明确诊断 也可以通过进一步的测序来分析病毒流行株特定序列 为基因分型提供依据 两端为保守的非编码区 中间为编码区 5 端共价结合一小分子蛋白质Vpg 约7kDa 与病毒RNA合成和基因组装配有关 3 端带有polyA尾 编码区编码的病毒结构蛋白VP1 VP4 VP1 VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面 有中和抗原位点 VP4位于衣壳内部 一旦病毒VP1与受体结合后 VP4即被释出 衣壳松动 病毒基因组脱壳穿入 逆转录PCR 或者称反转录PCR reversetranscription PCR RT PCR 是聚合酶链式反应 PCR 的一种广泛应用的变形 在RT PCR中 由一条RNA单链转录为互补DNA cDNA 称作 逆转录 由依赖RNA的DNA聚合酶 逆转录酶 来完成 一条RNA链被逆转录成为互补DNA 再以此为模板通过PCR进行DNA扩增 TypesofRT PCRReactions StandardRT PCRusuallywithone step recommended SensitiveandspecificNestedPCRMoresensitivethanstandardContaminationisamajorproblemOnlyforveryexperiencedlabsRealTimeRT PCRSensitiveandspecificReagentandequipmentcostsareafactorHighthroughput RT PCR实验程序 标本的采集 标本RNA的提取 引物 RT PCR反应体系 温度循环参数 琼脂糖电泳 凝胶成像 结果判定及序列测定 一步法 反转录PCR在一个管子里完成 得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增 灵敏度更高 两步法 反转录和PCR分开 灵活而且严谨 但灵敏度不如前者高 RNA操作注意事项 全程戴手套灭菌 清洁的塑料管或无RNA酶的玻璃制品高压带滤芯枪尖RNA提取试剂要保证无RNA酶所有试剂开盖时要标明日期在RNA提取 RT PCR和测序过程中使用无RNA酶水操作快捷 提取后的RNA应放在 70度备有冰盒 全程中保持RNA在低温状态下避免反复冻融RNA 防止RNA降解 PCR反应系统的组成 耐热DNA聚合酶 Taq酶 这是由耐热水生细菌体内提取的一种DNA聚合酶 模板DNA 即待分析的目的DNA 其长度不宜大于10kb 两种引物 为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸 需要两种引物 分别位于两条互补模板DNA链的3 端 四种脱氧核糖核苷酸 用作底物的dNTPS 缓冲溶液 保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值 PCR技术类似于DNA的天然复制过程 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 PCR由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 重复循环变性 退火 延伸三过程 就可获得更多的 半保留复制链 而且这种新链又可成为下次循环的模板 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 到达平台期 Plateau 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝 PCR注意事项 PCR关键环节 模板 引物 酶dNTP 循环条件 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究 模板 1 杂质蛋白质 特别是染色体中的组蛋白 2 Taq酶抑制剂 3 在提取制备模板时丢失过多 4 模板核酸变性不彻底 5 模板降解 RT PCR的关键步骤是在RNA的反转录 要求RNA模版为完整的且不含DNA 蛋白质等杂质 引物 引物质量 浓度 两条引物的浓度是否对称 是PCR失败或扩增条带不理想 容易弥散的常见原因 有些批号的引物合成质量有问题 两条引物一条浓度高 一条浓度低 造成低效率的不对称扩增 对策为 选定一个好的引物合成单位 引物的浓度不仅要看OD值 更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳 一定要有引物条带出现 而且两引物带的亮度应大体一致 如一条引物有条带 一条引物无条带 此时做PCR有可能失败 应和引物合成单位协商解决 如一条引物亮度高 一条亮度低 在稀释引物时要平衡其浓度 引物应高浓度小量分装保存 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分 导致引物变质降解失效 引物设计不合理 如引物长度不够 引物之间形成二聚体等 Mg2 酶 Mg2 浓度 Mg2 离子浓度对PCR扩增效率影响很大 浓度过高可降低PCR扩增的特异性 浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带 酶失活 需更换新酶 或新旧两种酶同时使用 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性 物理原因 变性对PCR扩增来说相当重要 如变性温度低 变性时间短 极有可能出现假阴性 退火温度过低 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率 退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差 dNTP浓度过高 Mg2 浓度过高 退火温度过低 循环次数过多引起 其对策有 1 减少酶量 或调换另一来源的酶 2 减少dNTP的浓度 适当降低Mg2 浓度 增加模板量 减少循环次数 3 减少模板量 如何避免污染 严格分区 标本处理区与PCR扩增区 产物分析区 要有一定的隔离 操作器材专用 要有一定的方向性 如 体系配制 标本制备 PCR扩增 产物分析 产物处理 试剂 引物和探针尽量分装 不要原瓶多次取用 加样 原则是模板最后加 其他试剂按照体积从大往小的加 操作多份样品时 制备反应混合液 先将dNTP 缓冲液 引物和酶混合好 然后分装 这样即可以减少操作 避免污染 又可以增加反应的精确度 耗材 使用一次性吸头 严禁与PCR产物分析室的吸头混用 PCR产物 机器运行完后 取出PCR产物时不能随便丢弃 应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶 TRIZOL法提取核酸RT PCR法检测柯萨奇病毒 两步法 逆转录 RT 聚合酶链反应 PCR PCR产物的检测和鉴定引物 CVB3的3D基因引物 TRIZOL法提取核酸1 取250ul病毒悬液加到1 5ml离心管中 然后加入750ulTRIZOL溶液 混匀5秒后离心 2 加入200ul氯仿溶液 充分混匀5秒钟3 室温放置10分钟后 10000RPM 室温离心20分钟4 将上清液转移到一支新的1 5ml离心管中5 再加入500ul异丙醇溶液 摇匀10秒钟6 室温静置至少15分钟7 14000RPM 4 离心25分钟8 倒掉上清液 加入950ul冰冷的70 乙醇9 14000RPM 4 离心20分钟10 用吸尖小心吸出上清液倒掉11 室温干燥后加入15uldH2O 70 保存 逆转录 RT 配液 RNA3 l 1 g 随机引物1 l加水至10 l混匀 瞬时离心 70 5min立即冰水浴 瞬时离心 依次添加下列试剂M MLVBuffer5 4 ldNTP10mM1 lM MLV200U l1 l加水至20 l 混匀 瞬时离心 42 15min 95 5min 4 维持 cDNA于 20 冰箱冻存 聚合酶链反应 PCR 配液 25ul体系2 mix12 5 PrimerA 100ug ml 1ul PrimerS 100ug ml 1ul cDNA1ul ddH2O9 5ul 反应程序 95 5min95 15sec60 20sec 35cycles72 20sec72 10min4 保存 PCR产物的检测和鉴定1 取100ml电泳缓冲液 1 TAE 加入到干净的三角瓶中 再加入1 7g琼脂糖粉末 轻轻摇动三角瓶 是琼脂糖微粒呈均匀混浊状态 2 微波炉加热使琼脂糖熔化 3 熔化的琼脂糖自然冷却到60 左右 加入5ul溴化乙锭 EB 混匀后倒入已准备好的胶床中 凝胶厚度约为0 3 0 5cm 4 室温下静置 凝胶固化 拿出已经做好的胶 将带凝胶的胶床置于电泳槽中 5 向电泳糟中加入电泳缓冲液 1 TAE 缓冲液的量以超过凝胶表面1 2mm为宜 6 核酸样品5ul中加入大约1ul的6 loadingbuf