DNA的复制损伤与修复

Replication and damage repair,第二章 DNA的复制、损伤和修复,第一节 DNA的复制(Replication, DNA biosynthesis),指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程。,哺乳动物的细胞周期,（一）半保留复制 DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。,意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。,一、DNA 复制特征,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作CsCl密度梯度离心.,半保留复制证据,（以原核生物 大肠杆菌为例）原料： dNTP，Mg+双链DNA模板引物（primer），常是RNA，有游离的 3OH。引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物 解螺旋酶 ( helicase ) , DnaB, 由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（Ori C）上解开双螺旋。,与复制有关的酶和因子,复制的起始点与方向,亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动,复制起始点（ori）：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点原核：一个起始点，约245bp,特殊的重复序列 真核：多个起始点,ori,E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包括两个关键序列：13bp的序列和9bp序列,它是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。,13bp序列区，每一个顺序都由GATC开始，富含A和T，有助于螺旋解开，控制复制何时开始。,9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特异结合，当dnaA蛋白（约20种）结合于ori的4个部位上时复制开始。 dnaA蛋白（一种专一的蛋白）和ori结合后，双螺旋解开形成复制叉。故dnaA蛋白与启动解链有关,dnaA蛋白是起始的关键成分。,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子(replicon)，每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)，可能还有终止复制的终点(terminus)。每个起始点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。,（二）复制子,一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点。一个完整的复制子在一个细胞周期只复制一次(真核)。 原核生物染色体和质粒都是独立（只有单一个）复制子；真核细胞染色体中有多个复制子组成。,DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制. 但在低等生物中,也可进行单向复制（如滚环复制）. 原核细胞：染色体和质粒 固定起点 双向复制，. 真核生物：染色体DNA，复制时多个起始点。,（三）复制方向,复制方向,DNA合成的方向单向、双向？,1个起始点,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验),将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（ B ）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ A ）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。,双向复制,复制子,真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段,以起始点为中心，向两个方向进行复制,多个起始点,二、 DNA复制的酶学,1. 模板：解开成单链的DNA母链,3. DNA聚合酶，DNA-pol,2. 底物dNTP ：dATP，dGTP，dCTP，dTTP,4. 引物（primer）：RNA引物,5. 其他酶和蛋白质因子,解链相关酶类,1. 解旋酶(helicase),2. 拓扑异构酶（topoisomerase I、II）,3. 单链DNA结合蛋白(SSB),DNA解旋酶(helicase)（解链酶） 功能：DNA的双螺旋解链（解DNA双链），解开一对碱基，需2分子ATP， 作用点：DNA上局部单链处，向双链方向解链。 种类：E.coli有四种解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。 I、II、III中任一种沿模板5-3 方向移动，rep蛋白沿模板3 -5方向移动。,拓扑异构酶（Topo）,DNA正超螺旋与负超螺旋,负超螺旋,正超螺旋,DNA双螺旋,拓扑异构酶,首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。 另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶来完成，但它对正超螺旋无作用。,型拓扑异构酶,由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。 两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组中均发挥重要作用。,型拓扑异构酶,拓扑异构酶 I 抑制剂：喜树碱类拓扑异构酶 II 抑制剂：依托泊苷，多柔比星，阿霉素类等,单链DNA结合蛋白（SSB）,作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解,SSB,DNA聚合酶（DNA-pol） 即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）,真核生物有多种： DNA-pol 、,原核生物有3种： DNA-pol、 、 ,DNA聚合酶功能,53聚合作用53外切酶35外切酶活性,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用转化率主要功能活性（nt/min）,DNA聚合酶,DNA聚合酶（复合物）,109，000400+1校读,修复1000,120，00040+-0 .05,400，00010-20+50复制100000,特 性,不清填补缺口50,引物酶(Primase)和引发体,催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶,DNA合成需在RNA引物的基础上进行,DnaA,引发体（primosome）：包括解螺旋酶 、DnaC、引物酶及DNA复制的起始区域,小 结,主要成员,主要作用,DnaA 识别复制起始位点,解螺旋酶 解开DNA双链,SSB 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,TOPO 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA-pol DNA复制,DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,三、复制的化学反应,生成磷酸二酯键,+ dN2TP,+PPi,DNA pol,3TAGAAGACCTATTGGCC5,5ATCTTCTGGATAACCGG3,第三节 DNA生物合成过程,1.复制的起始,2.链的延长,3.复制的终止,一 复制的起始,(一) DNA解成单链,由特定蛋白质识别复制起始位点（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉,倒Y,(二)引发体的生成,解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体,（三） RNA引物的合成,参与复制起始的蛋白因子,名称,功能,DnaA蛋白 辨认起始点,解螺旋酶（DnaB，Rep） 解开DNA双链,DnaC 协助解螺旋酶,引物酶（DnaG） 催化RNA引物生成,SSB 稳定解开的单链