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在昆虫中序列相似蛋白组学：Brazilian Moth Cerodirphia speciosa毒液的成分鉴定使用串联质谱测序和序列相似性搜索,我们对Brazilian Moth Cerodirphia speciosa的幼虫毒液的成分进行了表征,此蛾属于天蚕蛾科鳞翅目。尽管可用的数据库序列资源缺乏,这种方法使我们能够识别58点中的48个点并试图对其做二维凝胶电泳图,代表37独特的蛋白质,而只有13种蛋白质可以被传统非容错数据库搜索方法识别。大多数的跨物种采样数来自系统发育相关的鳞翅类生物中桑蚕家蚕的蛋白质。幼虫毒液的蛋白质成分配方暗示C. speciosa的毒素可能会通过其血淋巴接触引发毒害,类似于另一种有毒鳞翅目，巴西天蚕蛾。关键词:MS BLAST同源性搜索昆虫蛋白质组学串联质谱昆虫毒液前言Brazilian Moth Cerodirphia speciosa属于鳞翅目天蚕蛾科的新天蚕蛾亚科。Lepidopterian幼虫身体便面的刚毛,如天蚕蛾科家族的幼虫,对人类来说是危险的。偶然接触他们的刚毛和刺会导致灼烧的疼痛感,肾功能衰竭,鼻衄,黑粪症,血尿,严重出血,有时会导致死亡。然而,无论是Cerodirphia属的毛毛虫的毒液构成,还是特定的毒液的介质尚未确定。蛋白质组学表征的有毒液体来自于螫毛和毛毛虫的刺,可能有助于阐明毒性机制和开发适当的药物。鳞翅目包含超过150000种蝴蝶和飞蛾。目前,只有来自多个物种的106序列高度同源蛋白质在整个天蚕蛾科家族是已知的,新天蚕蛾亚科,其中包含分类学确认的142种。天蚕蛾科从蛋白质数据库中没有蛋白质可被利用，因此蛋白质识别只能依靠跨物种从其他鳞翅目物种序列去匹配,如丝绸蠕虫家蚕和烟草天蛾的幼虫或亲缘关系更远的昆虫序列,比如黑腹果蝇或冈比亚疟蚊。基因组、EST（表达序列标签）和蛋白质序列数据库通过质谱分析提供一个蛋白质鉴定的资源。在典型的蛋白质组学中, 通过特定的蛋白酶(多数情况下,胰蛋白酶)进行蛋白质胶内酶切,或溶液内酶切。未分离的胰蛋白酶的水解液经过肽质量指纹谱技术,完整的肽质量受它的精度高低决定。另外,肽的序列是由串联质谱测定,要么直接从未分离的混合物测定,或通过纳米微流反相色谱法在线分离(参照参考文献10)。大量的完整的胰蛋白酶的肽(肽质量指纹识别),或者加上大量的衍生片段通过离子化的串联质谱,然后从数据库条目相应的质量计算的处理序列。尽管有显著的不同, spectrum-to-sequence相关性和得分算法及其程序实现,传统的蛋白质识别软件,如Mascot与SEQUESR,主要是能够分析多肽的精确匹配至数据库序列（参照参考文献13,14）。严格的匹配大大增加了特异性的数据库搜索,有助于克服串联质谱固有的缺乏使用光谱识别的蛋白质,使从只有少数片段获得肽前体。然而,任何分析肽序列对应的数据库条目之间的差异,通常在失配和排除了识别结果的蛋白质。这代表了一个重要瓶颈表征与非序列蛋白质组的物种基因组,特别是对昆虫的蛋白质组学影响，因为在生物与未定义的遗传背景之间的系统发育多样性和蛋白质序列的显著高种群差异。我们在这里证明结合质谱分析和序列数据库相似性搜索有助于规避这些限制并且为高效的昆虫蛋白质组学勘探铺平了道路,尽管缺乏可用的序列资源。为了描述C. speciosa配方的毒液,我们通过二维凝胶电泳分离蛋白质并且蛋白质的识别通过质谱，Mascot联用和基于质的BLAST方法搜索驱动的。MS BLAST是一个序列相似性搜索工具,它利用多余、退化和部分序列错配的备选序列,通过的串联质谱的翻译来获得。从所有获得的串联质谱推导出所的有候选序列,以任意顺序组装成一个查询。重要的是,许多备选序列接受每个肽分析,因此,序列可以从低干度的MS / MS光谱推导明确的解释经不起实验的推敲。与常规的BLAST搜索相比,采用E值和p值评估统计采样的置信度, MS BLASTL利用另一种得分方案中,基于预计算阈值的分数有条件地设置在获取高比值片段对 (高敏感人群)和碎片的总数。根据超过20 000 MS BLAST搜索查询被组装的4500个蛋白质的计算评估结果得出,假阳性标识不超过3%。虽然对全面执行搜索总是对序列数据库执行全面的搜索，,但真正阳性标识通常取决于系统的距离与相关参考生物(s)和不同的系统发育血统之间的显著不同。MS BLAST方法成功的运用于鉴别非洲爪蟾,死海杜氏盐藻,甲醇酵母属毕赤酵母属酵母，圣栎硬木和其他物种的非序列基因组中的未知蛋白。然而， MS BLAST从广布的昆虫中鉴定的性能对系统发生的时间的测序参考物种尚不能被评估。使用质谱和容错结合和严格的数据库搜索方法,我们鉴定了从毛毛虫毒液中以二维电泳检测出的58个蛋白质斑点中的48个。序列相似性搜索启用两倍的独特的蛋白质,通过严格的数据库搜索,与跨物种标识相比,通过昆虫蛋白质的自然多态性它的置信度并不会失去。在毒液中大量的血淋巴蛋白质指出Cerodirphia speciosa的毛毛虫和有毒生物Lonomia obliqua之间系统发育相关的毒液的分泌和产生机制之间的相似性。材料和方法C. speciosa Caterpillarsc.C. speciosa Caterpillarscol采集自巴西的巴西利亚的大学生物学试验站,并且以树叶喂养从他们被发现的地方。在提取毒液以前，清洁和喂养每周进行三次。一些毛毛虫被允许发育成飞蛾进行随后的分类学分类,由巴西，巴西利亚的Amablio Jose Aires de Camargo at Centro de PesquisaAgropecuaria dos Cerrados执行。毒液提取。12个一组的毛毛虫，约6厘米长,在解剖前20分钟保持在-20C。毛纤维，使用手术刀从他们的基部去除。从缺口处漏出的几滴毛发分泌用巴斯德吸管收集并且用真空离心干燥。氨基酸分析。在两个独立的实验中,1mg和150g的毛纤维分别溶解在100L和75L的0.1M的盐酸中。毛发分泌物的酸水解样本和蛋白质标准液标准被放在109C 6M HCL真空下24 h。在酸水解后，样品和标准液被溶解在在75L的 0.1M HCl中,其中50L被注入到氨基酸分析仪日立L8500(日本，东京)。总蛋白含量被总结计算确定恢复的氨基酸。通过二维凝胶电泳分离毒液蛋白。这是根据 Gorg 等人的方法论的介绍执行的.IPG胶条购买自Amersham Biosciences(乌普萨拉,瑞典)。等电聚焦是在一个带有11cmIPG胶条,pH值3 - 10的 IPG-phor系统（Amersham Biosciences）上完成的。等分的毒液(150g)溶解在250L包含7 M尿素,2 M硫脲,1%DDT,2% Triton x - 100,0.8%两性载体(Pharmalyte),1%的蛋白酶抑制剂(TLCK,PMSF TPCK,EDTA,抑肽素,亮抑酶肽)和的痕迹溴酚蓝。样品在台式离心机中10000r/min离心5分钟。复水的IPG胶条在20C条件下放置13个小时。等电点聚焦运行跟着一个程序4 h在恒定的每个胶条75A, at 500V/一小时; 1000 V/一小时 and 8000 V两小时。在那之后,他们将保温20分钟在一个包含50mM PH8.8的胶条，6M尿素,30% v / v甘油,2%w / v SDS和125mMDDT的溶液中（3ml）紧接着放入一个用125mM碘乙酰胺代替DDT的相同的平衡液中20分种，。然后胶条在37.5mM包含0.3 M甘氨酸和0.1MSDS的Tris缓冲液中冲洗5分钟。IPG胶条被密封在包含0.3%琼脂糖的Tris SDSPAGE缓冲液中进行二维凝胶电泳,执行一个的梯度(7%到15%的丙烯酰胺-双丙烯酰胺)进行。电泳在25mA,500 V的限制电压和15C条件下进行。包含0.24 M Tris HCl pH8.8, 12% 蔗糖, 2% SDS,1% DTT and 痕迹溴酚蓝的溶液作为样品缓冲液。凝胶着色考马斯亮蓝。近负载蛋白质的近似数量估计通过有四个蛋白质斑点对应点的染色强度比较的强度标准取决于氨基酸分析。蛋白质质谱鉴定。个体蛋白质斑点在二维凝胶电泳被手动切除且蛋白质染液溶解于胰蛋白酶。蛋白质消化第一次受到肽质量指纹识别通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)配备Scout384离子源。探针准备方法如前所述。简单的,1L等分的消化液混合在AnchorChip 384/600靶标表面(Bruker Daltonics, Germany)的饱和溶液基质(-氰-4-羟基肉桂酸)在1:2 (v/v)2.5%的TFA:乙腈的溶液。混合物在室温下干燥和全部靶标是用5%甲酸清洗。如果肽质量指纹没有识别蛋白质,从含有5%甲酸和乙腈的凝胶块上肽并且提取物汇集在一起,真空干燥离心。消化液带入了5%甲酸并且运用纳升电喷雾串联质谱分析,在前面所描述的MDS Sciex QSTAR Pulsar 四极杆飞行时间(QqTOF)质谱上修改。几个丰富度低的蛋白质斑点(表1种显示)通过nanoLC-MS / MS分析线性离子阱质谱仪LTQ(ThermoElectron Corp，CA)本质上所描述的。32质谱数据和数据库的处理搜索。肽质量指纹被用于数据库搜索使用Mascot软件(Matrix Science Ltd, UK)针对MSDB数据库从NCBI下载(9月，2004)。质量公差表被设置为100 ppm,光谱被外部校准和没有强加的限制蛋白质分子量或物种起源的蛋白质分析。粗略的串联质谱第一次搜索通过Mascot对上面的数据库来识别蛋白质包含胰蛋白酶的多肽组成相同的目前的数据库条目,在0.1 Da的前体质量容差和0.05Da碎片离子得质量容差。袭击被认为是重要的如果他们的蛋白得分超过了阈值吉祥物软件计算假设p 0.05,取决于-荷兰国际集团(ing)在查询的大小,是50-52。相应的女士/女士光谱是手动检查确认的匹配连续的一系列y,b -,-碎片离子。吉祥物查询生成使用过程从MS / MS谱荷兰国际集团(ing)脚本吉祥物v.1.6b2 BioAnalyst QS的延伸软件应用生物系统公司(CA)福斯特市。串联质谱收购nanoLC-MS LTQ / MS方法离子阱质谱仪被吉祥物在搜索以下设置:对前体和质量碎片离子2和0.5 Da,尊重;碎片离子简介:ESI陷阱。如果三跨物种击中被接受标准同时满足:蛋白质分数超过阈值计算为p 80%)(表1)。就像预期的,所有这些标识是由跨物种已知相对匹配吗从其他昆虫守恒的蛋白质。大多数跨从过去的物种击中了蛋白质有关丝绸蠕虫家蚕,只有一小部分与蛋白质与其他昆虫的物种达成一致与之前报道的那样计算估计。21岁的确认点38个人代表蛋白质。MALDI肽质量指纹识别只有三个强烈保存细胞骨架proteinssactin、微管蛋白和tropomy -osin。串联质谱分析和严格的(吉祥物)数据库搜索确定进一步11蛋白质。在三个案例一个肽是一个数据库条目和匹配统计学意义的,由他们MOWSE表示得分,11是边缘。这些随后被验证女士的爆炸搜索详细如下所述。采取在一起,传统的数据库搜索(肽的方法质量指纹和吉祥物)启用的识别14(38%)的蛋白质。 串联质谱获得的消化身份不明的蛋白质斑点新创和解释爆炸序列候选人提交女士搜索。对蛋白质数据库搜索另外确认25蛋白质,从而增加患者的成功率,比较传统数据库挖掘方法(表1)。吉祥物搜索三个蛋白质斑点只匹配一个蛋白质序列与边际意义,女士爆炸con -fidently匹配三至五肽。然而,这将是谨慎的注意,甚至统计自信的标识不一定支持直接赋值的生物功能。37基于sequence-similarity标识英蒂确定识别尤其重要上一个完整的序列相似性序列长度和参考蛋白质,或本地相似的守恒域在否则功能不同的蛋白质序列。为此,我们仔细检查了爆炸冲击女士的列表检查其他nonho如果相同的多肽序列匹配mologous蛋白质较低的信心。在试图提高识别成功率,我们也一样试着从Bombyx女士爆炸对EST序列搜索森。虽然在许多情况下,爆炸袭击美国东部时间女士se -quences与一至五完全匹配的肽,随后blastx搜索全长序列的记者EST克隆没有产生新的标识,除了那些已经在蛋白质数据库中。 强烈的昆虫蛋白序列多态性妨碍了他们的识别。由于完整的质量,和大量的碎片离子的多肽变体,是不同的,他们不被传统的数据库搜索软-器皿。然而,女士爆炸搜索多个错误容忍之间的匹配和氨基酸替换查询se -quences(即。,在肽序列由质量来决定的光谱法)和数据库序列,因此容忍高个人wild-bred简并的蛋白质序列昆虫。在分析五个蛋白质斑点我们观察到两到四个变量相同的肽序列,和他们成功匹配到相应的数据库女士序列的爆炸(表3)另一个人的基因组生物的鳞翅目familyssilk蠕虫Bombyx moris最近变得可用。所有爆炸女士查询随后对原始基因组序列搜索con -认定的几个叠连群爆炸女士的修改版本,这是基于tblastn(而不是blastp)搜索算法。虽然这些也没有产生任何的搜索新标识,而女士对爆炸搜索蛋白质数据库,在许多情况下基因组女士爆炸了缩小的同源蛋白在几个昆虫对通讯员家蚕基因,因此改善他们的功能注释。确定蛋白质和毒液毒性的可能来源。c .叶卡特彼勒毒液是一个复杂的蛋白质混合物细胞内(幼虫表皮蛋白,calreticulin醛脱氢酶2和过氧化氢酶)或血淋巴(存储支持爱因斯坦,apolipophorin二世,pro-phenol氧化酶亚基1,hemolin,和转铁蛋白)。它还包含丰富的管家蛋白质,参与能量代谢(酒精dehydroge -nase prophenoloxidase,和其他人)、铁和钙存储(转铁蛋白和calreticulin),脂质储存和运输(“分离”细胞骨架的lipophorin)以及无处不在的组件(肌动蛋白、肌球蛋白、肌钙蛋白)和Ca-dependent脂质绑定蛋白质(膜联蛋白)。Insect-specific蛋白质被提出的是一些表皮和chitin-binding蛋白质丰富的昆虫皮肤组件和蛋黄hemolin,参与免疫反应。有趣的是,我们发现点8和9的同系物假设蛋白质13(Q5MGN4)从高度hemor -rhagic卡特彼勒Lonomia obliqua。 虽然所有主要景点二维凝胶被确定,我们没有发现常见的有毒成分多少动物毒液,如磷脂酶、蛋白酶和神经毒素。38我们以前大量的磷脂酶和识别神经毒素分子从蛇的毒液,具窍蝮蛇属atrox,跨物种匹配不同的物种,分开从爬行动物(舍甫琴科et al .,未发表)。磷脂酶从果蝇取(CG14507-PB)和冈比亚按蚊(AgCP13927)分享69%的序列的身份及其同系物发现全身蛋白质爆炸在b . mori搜索基因组,因此很可能c .叶phospholi -进出将识别序列相似性搜索。21因为我们也没有观察磷脂酶的活动粗毒液,我们得出结论,磷脂酶可能只存在于一个非常微量,不可能负责毒液的毒性。大量的血淋巴蛋白促使我们specu -晚,c .配方可能使用类似的机制生产和分泌的毒液,出血性卡特彼勒Lonomia obliqua。26 Veiga上皮描述等突显出刺,由专门的细胞名单-荷兰国际集团(ing)的毒液,然后存入细胞外上皮细胞之间的空间和脊柱角质层predomi -nant集中在脊椎的技巧。39如果毒液,分泌细胞同样位于c .配方,然后批量收集到的分泌会由血淋巴,居住在刷毛的内部,以及细胞内蛋白质,可能来自受伤的上皮。Arocha -销ango和Layrisse 40证明下毒进行通过注入血淋巴和其他身体毛毛虫的液体。鳞翅目的血液毒性物种之前已经观察到。40-42虽然我们不能确定蛋白质的毒性明显,我们不能排除可能存在,他们遍布斑点,根据他们的肽质量指纹-打印,代表五个蛋白质仍然不明。他们