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浙江农林大学本科生毕业设计（论文）本 科 生 毕 业 设 计（论文）（ 2015 届）农业与食品科学学院题 目： 食用百合离体鳞茎诱导及膨大影 响因素研究 学 号： 姓 名： 专业班级： 指导教师： 职称： 职称： 2015 年 5月19日本科生毕业设计（论文）诚信承诺书我谨在此承诺：本人所写的毕业设计（论文）食用百合离体鳞茎诱导及膨大影响因素研究 均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了引用注释，如出现抄袭及侵犯他人知识产权的情况，后果由本人承担。 承诺人（签名）： 年 月 日食用百合离体鳞茎诱导及膨大影响因素研究 摘要：采用食用百合三个品种的鳞片为试验材料进行百合的鳞茎诱导以及膨大的技术研究。实验结果表明：1.百合的不定芽诱导研究发现，宜兴百合TF鳞片诱导在浓度激素配比为1.0 mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA时的诱导数为14.13，最佳值；宜兴百合MY以及龙牙百合鳞片在浓度配比为1.5mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA的最佳诱导数分别为16.56、8.83；2.继代培养试验研究发现，宜兴百合MY组培苗在1.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L 6-BA的浓度配比下，增殖系数达到2.04最大值；3.宜兴百合MY鳞茎膨大试验研究发现，在一定范围内，鳞茎的膨大的增重量随着蔗糖浓度的上升而增加；当蔗糖浓度120 g/L时，鳞茎的膨大程度最大，并且鳞茎的增重量、增重倍数、平均增重量以及鳞茎的个数增加量都处于最大值。宜兴百合MY鳞茎膨大中多效唑因素试验研究发现，当多效唑浓度高于、等于5 mg/L时，鳞茎生长受到抑制，生长缓慢并且出现畸形。 关键词：食用百合；组织培养；初代诱导；鳞茎膨大The research of isolated scale of edible lilys inducting and expansion growthAbstract:this study take the two varieties Lily of Yixing and bandits bulb scales to find a good way to induce the swelling and proliferation of lily . The experimental results show that: 1. In three varieties of Lily adventitious bud induction, there is a big difference between the Longya Lily and Yixing lily, the induced velocity of Longya Lily faster, the growth rate is faster later; 2 .Yixing Lily MY subculture found in the experiment, the plantlets of 1 mg/L NAA + 2 mg/L 6-BA concentration the ratios, most of vitrification phenomenon; and in the test concentration ratio of 1.5 mg/L NAA + 0.5 mg/L 6-BA is more suitable for seedling subculture; 3 .In the experimental study bulbification found, in a certain range, sucrose concentration and bulb swelling proportion; when the sucrose concentration of 120 g/L, the MY index of Yixing Lily bulb,increase the amount of weight gain, weight increase, average weight gain and small bulbs are in the best value found in the study of single factor test; Paclobutrazol, when Paclobutrazol concentration is higher than, equal to 5 mg/L, the abnormal growth of bulbs.Key word：Edible lily; tissue culture; early induction; bulb swelling目录1 前言12 材料与方法2 2.1 材料2 2.1.1 外植体2 2.1.2 培养基22.2 试验方法2 2.2.1 外植体的准备及诱导 2 2.2.2 百合的鳞片诱导2 2.2.3 百合的继代增殖培养2 2.2.4 组培苗鳞茎的膨大培养33 数据处理与分析33.1 百合鳞片的不定芽及鳞茎诱导33.2 不同配比 NAA 和 6-BA 对宜兴百合继代增殖培养的影响43.3 鳞茎膨大培养结果分析43.3.1 不同蔗糖浓度对鳞茎膨大的结果分析43.3.2 不同PP333浓度处理下的鳞茎膨大结果分析44 结论与讨论55 参考文献76 致谢71 前言百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）又名番韭等，是百合科百合属的多年生草本球根植物。中国是百合的原产地，亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区也有分布。目前全球已经发现有了至少120个品种，其中产于中国的有55种，近年人工杂交的新品种也在不断的问世，如亚洲百合、香水百合、火百合等。百合鳞茎含丰富淀粉，可食用，也可以药用。百合鳞茎富含蛋白质、脂肪、还原糖、淀粉以及钙、磷、铁、维生素B、维生素C等营养成份以及秋水仙碱等多种生物碱，具有良好的营养滋补之功，对一些由于季节气候干燥引起的疾病有一定的防治作用。从中医上讲鲜百合具有养心安神，润肺止咳的功效，也有利于病后虚弱的人恢复身体。在我国可食用的百合种类有10个左右，栽培较多的品种有宜兴百合、兰州百合、龙牙百合等。宜兴百合，学名卷丹，又名虎皮百合，原产我国宜兴及湖州一带，其鳞茎肉质肥厚，营养丰富，具有良好的药效和保健功能，花型奇特，花色艳丽，具有较高的观赏价值。龙牙百合，栽种于湖南(隆回、安化）、江西（万载、永丰中西山）等地，是白花百合中的优良品种，淀粉含量高，营养丰富，味淡不苦。百合的常见繁殖方式有分球繁殖、种子繁殖、扦插繁殖、珠芽繁殖、组织培养等，其中种子繁殖过程中，百合性状分离容易出现优良性状退化的现象。分球繁殖、种子繁殖、扦插繁殖、珠芽繁殖，这四种繁殖方式都具有育苗缓慢的缺点，2-3年才能形成商品球。近年来,随着全球百合种球贸易的扩大，我国百合进口、引种数量和种植面积的不断增加,加之不规范的种植和种球自繁，病毒病开始在各百合种植区迅速流行。据统计，我国百合病毒的发病率一般在40%50%，二代种球的带毒率在90% 以上，病毒病已成为加速我国百合种群衰退的重要因素之一。植物组织培养又叫离体培养，广义上指从植物体分离出符合需要的组织、器官或者细胞、原质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或者具有经济价值的其他产品的技术。组织培养方法能保持原种的优良特性，并且繁殖系数很高。但百合试管苗在出瓶移栽过程中存活率低，容易重新感染病毒。采用试管内形成鳞茎的组培方法，可提高成活率、降低污染和感染病毒的机率，有利于种质保存实现植物无性系的快速繁殖、培育无病毒种苗、新品种的选育等等。目前，组织培养技术在观赏百合品种上应用较多，而在食用百合上的研究相对较少。百合组织培养的常见外植体有鳞片、根、叶片、子房、种子、花梗、花瓣、珠芽、花柱、花丝、花药、胚、腋芽、芽尖等许多器官和组织，其中使用最多的外植体是鳞片。百合鳞片作为外植体具有容易获得，分化能力强，对培养基要求不严等优点，是目前百合组织培养中普遍采用的外植体。鳞茎作为外植体，其诱导能力的大小依次是内层中层外层，并且不同层次的鳞茎的增殖配方略有差异1。观赏百合和药用百合的鳞茎膨大试验中蔗糖、多效唑、活性炭、水杨酸等物质是影响鳞茎膨大的关键因素2。其中，多效唑(PP333）是一种广谱性生长延缓剂，能使植株分枝增多、促进壮苗、生根，且有矮化作用。在一定范围内，随着多效唑浓度的增加，结鳞茎率迅速提高，直径明显增粗，对叶片和根的分化、生长有明显的抑制作用2；多效唑浓度过高时不定芽的生长严重受到抑制，试管鳞茎明显矮化，没有根、叶产生。蔗糖在鳞茎膨大的试验中也有至关重要的作用。多数人试验研究结果表明鳞茎的膨大程度随着蔗糖浓度的上升而加强，但是不同品种的百合鳞茎膨大的蔗糖最佳浓度各不相同，有的研究表明百合鳞茎膨大的蔗糖最佳值为10 %，也有研究发现12 %为百合鳞茎膨大的最适值3。活性炭又称活性炭黑，是黑色粉末状或颗粒状的无定形碳。活性炭在植物的组织培养中具有提供暗环境、吸附离体培养中的抑制物以及生长调节剂，对离体培养有益物质解吸附等作用。在百合的鳞茎膨大研究中，加入活性炭后，鳞茎质量明显提高，鳞片增厚，叶片生长数量明显减少，根系生长良好4。纵观百合的组织培养研究发现，有关于观赏百合的研究数量高于食用百合，并且不同品种观赏百合同一方面的研究结果差异略大。这就要求后来研究者不断的来完善不同百合品种的诱导、继代以及膨大等方面的体系。在组织培养过程中，研究者可以发现组培苗继代培养多次后容易出现鳞茎发育慢、叶根长势柔弱的现象，严重影响百合组培苗的移栽成活，容易重新感染病毒。采用试管内形成鳞茎的组培方法，可提高成活率、降低污染和感染病毒的机率，有利于种质保存，提高结鳞茎率, 克服上述缺点。但是由于百合的品种繁多，不同品种百合的膨大条件都存在一定的差异性，并且组培苗的鳞茎膨大存在鳞茎形成时间长，形成率、增重率低, 新增小球数较少等问题。因此本试验旨在以食用百合为原材料，对百合鳞茎诱导、增殖以及膨大进行探索，以便建立一条能迅速增加鳞茎的重量，有效促进壮苗，去除病毒，提高移栽成活率，实现短时间内获得大量生产用优质种球的目标，为百合的商业化生产提供一条有理论依据支持的途径。2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 外植体本实验的供试材料为产地江苏宜兴（MY）、湖南湘西（TF）的两种宜兴百合（Lilium lancifalium Thunb.）、龙牙百合（L.browniivar.viridulum）的除外层以及最内层的所有鳞片。 2.1.2 培养基 以附加蔗糖30 g/L、琼脂8.5 g/L的MS培养基为基础培养基，pH值5.8，添加不同浓度配比的植物生长调节剂，如多效唑、6-BA和NAA，以及不同浓度的蔗糖。培养基采用高压蒸气法灭菌，20 min。培养条件：温度(252),光照14 h/d，光照强度为20002500lx。 2.2 试验方法 2.2.1 外植体的准备及诱导 本次试验取食用宜兴、龙牙百合中外层无损伤的健康鳞片，用清水冲洗三遍，再用洗洁精浸泡10分钟，最后用流水冲洗2小时，放置超净台。在超净台内，先用酒精浸泡1min，再无菌水冲洗三次，最后用0.1%升汞浸泡15 min并用无菌水冲洗至少三次。 2.2.2 百合的鳞片诱导消毒后的鳞片，用解剖刀切除鳞茎的上部以及边缘部分后，再切割成大小均匀的小块（1 cm 0.5 cm）并且接种不同质量浓度(0.2、0.5 、1.0 mg/L) NAA和不同质量浓度(1.0、1.5、2.0 mg/L) 6BA的MS培养基（见表1）中进行诱导培养。每个处理10个外植体，重复3次，在接种30 d观察并记录不同品种鳞片的诱导情况。诱导数=不定芽或鳞茎数/原接种鳞片数 2.2.3 百合的继代增殖培养宜兴百合继代增殖过程中，将宜兴百合MY鳞片诱导培养出来的组培幼苗分别接种到添加到不同质量浓度(0.2、0.5 、1.0 mg/L)NAA和不同质量浓度(1.0、1.5、2.0 mg/L)6BA的MS培养基中进行增殖培养。每个处理接种20株无菌苗，3次重复，接入 40 d后统计不同生长调节剂质量浓度处理下组培苗的增殖数量、观察其生长情况。增殖系数=培养后组培苗总数/初始组培苗数。 2.2.4 组培苗鳞茎的膨大培养选取继代培养中宜兴百合MY的鳞茎大小相近、整齐一致的组培苗，去除叶片和根，接种到分别含有不同质量浓度的蔗糖、多效唑培养基。称量出小鳞茎的初始鲜重，并做好数据记录，每个处理接种20个小鳞茎，重复3次，并且记录鳞茎的初始鲜重以及培养60 d后的现鲜重，统计和分析处理数据。鳞茎增重=培养后鳞茎鲜重/初始鳞茎鲜重鳞茎增大倍数=培养后鳞茎鲜重/初始鳞茎鲜重增加个数=培养后鳞茎个数/初始鳞茎个数平均增重量=增重/增加个数3 数据处理与分析 3.1 百合鳞片的不定芽及鳞茎诱导本试验中，大部分鳞片都可以诱导出不定芽，但在不同的培养基条件下各个不定芽的萌发数量和生长态势都有差别；在诱导过程中，宜兴百合的TF、MY以及龙牙百合的鳞片分化出现两种不同的分化情况，一种是没有形成愈伤组织，直接产生不定芽；另一种是先形成愈伤组织，再从愈伤组织上分化出不定芽。但形成愈伤组织的只是少数，并且在愈伤组织形成几天后就分化出了不定芽；大多数鳞片还是以直接分化不定芽或者小鳞茎为主。通过观察研究结果发现宜兴百合和龙牙百合在分化速度、表型等方面存在较大的区别的，而宜兴百合中的TF、MY差异并不明显。在分化速度方面，龙牙百合的部分鳞茎7 d左右就有不定芽生长出来，并且不定芽数量较多；而两种宜兴百合在培养10 d左右才有不定芽分化出来。在百合的鳞片诱导过程中，不定芽具有单芽生长和丛生芽两种生长方式。在本次试验中宜兴百合TF、MY以及龙牙百合都以单芽形式生长，而龙牙百合不定芽的生长速度较快与两种宜兴百合。宜兴百合的TF、MY和龙牙百合分化出的不定芽的表型具有十分明显的差别，宜兴百合的两个品种均为翠绿色，而龙牙百合呈黄白色(见附录图二)。由表一可知，宜兴百合TF在1.0 mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA的培养基中，不定芽的诱导数量最多；宜兴百合MY以及龙牙百合的鳞片在1.5mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA的培养基中不定芽诱导数最大。表 1 三种百合鳞片材料在不同浓度配比下生长30 d的诱导情况试验编号质量浓度/(mg/L )不定芽诱导数6BANAATFMY龙牙11.00.214.1315.945.2821.00.510.1314.444.2831.50.57.1316.568.8342.01.09.7515.003.33 3.2 不同配比 NAA 和 6-BA 对宜兴百合继代增殖培养的影响在继代培养中，通过观察宜兴百合MY的长势可知，当控制6-BA浓度为1.0 mg/L时，增加NAA的浓度，组培苗的增殖系数呈上升趋势，并且组培苗的长势也略为良好；当控制NAA浓度为0.5 mg/L时，增加6-BA浓度，组培苗的增殖系数也在增加，但是增加的幅度略小；并且1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA和1.5mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA处理下的组培苗生长状况没有明显差异；而在 2.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L NAA处理下生长的组培苗大多数出现了玻璃化现象，极少数生长不正常，甚至畸形。表 2 不同配比生长调节剂处理宜兴百合40 d后的组培苗增殖系数试验编号质量浓度/(mg/L )组培苗增殖系数6BANAA11.00.21.4321.00.51.89 31.50.52.04 42.01.01.44 3.3 鳞茎膨大培养结果分析 3.3.1 不同蔗糖浓度对鳞茎膨大的结果分析在宜兴百合MY的鳞茎膨大试验研究中，组培苗在接入4种不同蔗糖浓度的培养基，培养60 d后，大部分生长状态良好，叶片较稀少，多数鳞茎逐渐生长紫黑色，并且鳞茎根系较多、粗壮，呈白绿色，少量组培苗的根系较细短，并且呈黑色状态。由表三可知，当蔗糖浓度处于30120 g/L范围时，鳞茎膨大的总体趋势与蔗糖的浓度成正比，鳞茎的直径也不断的在增大。当蔗糖浓度为120 g/L时，鳞茎膨大增重量达到本试验的最大值，同时鳞茎的增大倍数、平均增重量以及小鳞茎的结鳞数也处于最大值。其中当蔗糖浓度为60 g/L时，鳞茎的平均增重量较高于BP1以及BP3处理，但是小鳞茎的增加数目低于BP1以及BP3处理。表 3 不同蔗糖浓度处理宜兴百合组培苗鳞茎60 d的膨大增重情况试验编号蔗糖浓度/（g/L）增重（g）增重倍数平均增重(g)增加个数BP1300.578.030.1102.05BP2600.589.350.1411.00BP3900.6112.730.1102.25BP41200.7512.270.1443.00 3.3.2 不同PP333浓度处理下的鳞茎膨大结果分析在多效唑对鳞茎膨大的试验研究过程中，主要设置了0、5、7、9 mg/L这四个浓度阶梯。将宜兴百合MY接种与含有不同浓度多效唑的培养基，培养60 d后观察试验结果发现在多效唑浓度处于0 mg/L时，鳞茎生长正常，鳞茎颜色呈黑紫色，有少量叶片，并且有稀少的根系；当多效唑浓度处于5 mg/L及以上浓度时，鳞茎生长发现异常，鳞茎的个体在增大，几乎没有叶片，根系较稀少、不发达，并且无法明确区分鳞茎球的每一个鳞片，整体形态呈球型。表 4 不同PP333浓度处理宜兴百合组培苗鳞茎60 d的增重情况试验编号PP333浓度/（mg/L）增重增重倍数平均增重增加个数P000.5708.030.1102.05P150.5506.010.0467.41P270.6636.390.0566.75P390.7607.090.0835.694 结论与讨论在前人对百合鳞茎研究中，鳞茎的常用消毒方式有采用75%酒精消毒10 s，0.1 %升汞消毒 10 min，再用无菌水清洗5次；也有采用15%的84消毒液和0.1%升汞组合对兰州百合的外植体进行消毒。在外植体的消毒中，有通常都是用乙醇对材料进行预灭菌，使用浓度一般为70% 75%，灭菌时间为60 s；升汞的使用浓度为0.1% 0.2 %，灭菌时间为5 20 min左右；浓度为20.0 g/L的次氯酸钠溶液浸泡l0 min；漂白粉的使用浓度为饱和溶液，灭菌时间为10 20 min，灭菌时要不断摇动，材料灭菌后再用无菌水冲洗5次以上；也可使用2种灭菌剂，如先用1%次氯酸钠溶液浸泡，取出后放入0.10升汞溶液中浸泡7。在本试验的外植体处理中，主要采用清水冲洗三遍，再用洗洁精浸泡10分钟，最后用清水冲洗至少三次以上至干净，进入超净台。在超净台内，先用75%酒精浸泡1min，再无菌水冲洗三次，最后用0.1%升汞浸泡15 min并用无菌水冲洗至少三次的消毒方式。三种百合鳞片经过此种方式消毒后，宜兴百合的TF和龙牙百合的污染率高于宜兴百合的MY。在同样的培养条件下，甚至是同一个培养基配方下生长的宜兴百合、龙牙百合的鳞片不定芽的诱导速度都是龙牙的较快，并且宜兴百合和龙牙百合诱导出的不定芽的表型也存在较大差异，这可能取决于百合品种差异性。崔祺4的试验研究中提及由于百合的种、品种、品系间的基因型存在差异，所以百合诱导分化阶段的差异仍需探索。在两种百合鳞片的诱导过程中，大多数不定芽在鳞片的两侧以及基部诱导生长，其中两侧不定芽的生长数量与基部生长数量较多，相反鳞片上部的诱导率较低。由胡凤荣3试验研究可知，鳞片不同部位切段的不定芽分化速率和数量也存在差异，依次为:鳞片基部中部上部。NAA是植物生长调节激素中常见的生长素类似物，功能与植物生长素相同，可以促进细胞的分裂与扩大，诱导不定根的生成。6-BA也是植物生长调节剂中的一种 ，具有促进不定芽的形成,诱导愈伤组织发生的作用。在宜兴百合的继代培养的筛选试验过程中，由表3可知在NAA浓度都为0.5 mg/L时，随着6-BA浓度的增加，组培苗的增殖系数在不断的上升；在6-BA浓度为1.0 mg/L时，增加NAA的浓度，宜兴百合的组培苗增殖系数相差并不是很大。NAA作为植物生长调节剂的一种，主要起到根系诱导的作用。而当同时增加NAA和6-BA的浓度，宜兴百合组培苗的增值系数并为持续上升，相反是出现了下滑的迹象。这种情况是由于激素浓度过高，植物生长过程中多数组培苗出现了玻璃化现象。在降低一点激素浓度后发现可以降低组培苗的玻璃化现象。影响百合鳞茎形成和膨大的因素是多方面的，如生长调节剂的种类和浓度以及蔗糖、大量元素、活性炭(AC)、水杨酸、光照、温度等。而蔗糖作为培养基内唯一的供能物质以及碳源，对于鳞茎膨大的因素研究有重大的意义8。胡凤荣3研究表明蔗糖浓度对百合鳞茎形成影响明显；当蔗糖浓度为3% 时，没有小鳞茎形成；蔗糖浓度为10% 时，结鳞茎率最高。钱剑林、朱旭东等人研究东方百合时发现，培养基中蔗糖浓度在3.0% 7.5% 的范围内，随着蔗糖浓度的增加，促进鳞茎的形成和生长。本次鳞茎膨大试验中主要设计了两个因素，对其进行研究，从而确定一个能在最大程度上满足百合商业生产的一个膨大的增重值。鳞茎膨大试验材料都来自于宜兴百合MY的继代培养的组培苗，比较宜兴百合在膨大处理的前后，可以发现在膨大处理后的宜兴百合的叶片比较稀少、鳞茎呈黑紫色、根系比较发达。结合蔗糖因素的结果分析可以发现，蔗糖浓度越高，鳞茎的增重值逐渐增大，BP4处理下的鳞茎增重值、增重倍数、增加个数最大；而BP1处理的鳞茎增重值、增重倍数、平均增重值最小，而个数增加量仅高于BP2；BP3处理中的鳞茎增重倍数量处于最大值。从表三数据可以知道，不同处理下的鳞茎平均增重和个数增加量是一个相对的衡定量。当增重差别不大时，个数的增加上升之后，平均增重量自然会较。而在百合的商业化、工业化生产过程中，这两者数据都具体其存在价值，生产者可以根据其实际的需求选择相应的处理配方。因此，培养基配方为蔗糖浓度120 g/L有利于宜兴百合的鳞茎增重；蔗糖浓度90 g/L宜兴百合的小鳞茎个数的增加量较大。PP333处理宜兴百合鳞茎试验中，设计了0、5、7、9 mg/L PP333 四个浓度阶梯，不同浓度处理下的百合鳞茎的长势和表型有较大的区别。首先，当多效唑浓度为0 mg/L 和其他浓度处理下的鳞茎的根系和叶片上的区别的，0 mg/L处理中的鳞茎叶片呈翠绿色、根系绿白色，少数颜色呈黑色；P1、P2、P3处理下的鳞茎大多数几乎没有叶片，少数生长的叶片呈枯黄色，而根系随着PP333浓度的上升逐渐减少、变短、变细，颜色呈黑色；当多效唑浓度处于5 mg/L及以上浓度时，鳞茎生长发现异常，鳞茎的个体在增大，几乎没有叶片，根系较稀少、不发达，并且无法明确区分鳞茎球的每一个鳞片，整体形态呈球型。随着PP333浓度的增加,其矮化效果明显加强。在参阅了前人在百合鳞茎膨大方面的研究发现，多效唑对与不同品种的百合鳞茎起到一个膨大作用的浓度范围的差异星是比较大的。崔祺4在对索邦组培苗鳞茎膨大研究过程中发现3.0 mg/L PP333较适宜鳞茎增大，并且当PP333质量浓度超过10 mg/L 时部分小鳞茎生长变慢，鳞茎质量变差，散心现象严重并出现死亡。而张永平5研究发现15 mg/L PP333最有利于索邦鳞茎的膨大。这种差异可能是由于小鳞茎生理、生化状态不同引起的。在李小玲6对亚洲百合“精粹”(Elite)的研究中发现，其最适的百合壮苗的浓度配方为1.0 mg/L PP333。因此，在本试验处理下，鳞茎生长形式出现明显畸形的现象可能是由于百合品种不一致对多效唑的浓度适用范围有很大的差异。后人