发育神经生物学

发育神经生物学 Developmental Neurobiology,课程的性质 发育神经生物学(Developmental Neurobiology)是神经科学中一个重要的分支学科。它的研究包括神经细胞谱系的追踪，神经元和神经胶质细胞的发生、诱导、迁移、分化，轴突与树突的发育，突触的发生和神经网络的形成，各脑区的组织发生，发生后的发育、成熟、老化、退变，神经系统的可塑性、伤后的再生和修复，以及神经系统退行性疾病的发病机理和脑内移植的应用等方面，其范围极其广泛。近年来，随着分子生物学的深入研究，使神经系统发育中基因调控的研究有了较为迅速的发展。特别是关于与神经系统发育密切相关的同源盒基因(homeoboxgene)的研究发现，使这一领域受到更多的关注。从某种意义上说，现代发育神经生物学的研究，实质上是神经系统的发育再生及其基因调控的研究，因而是一个极其复杂的生物学过程。 发育神经生物学是神经生物学硕士研究生的学位课，54学时，主要讲授神经系统的发育、再生与细胞编程性死亡，神经系统的可塑性等。通过这门课程的学习，使学生初步掌握神经系统从发育至老化中的有关问题及调控与研究方法。,第一章 神经细胞的发育分化与神经系统 发育中的基因调控 神经元与神经胶质细胞的发育和分化是发育生物学研究的热点之一。细胞克隆（cell clone）：由一个细胞通过有丝分裂产生的具有同一遗传特征的一群细胞细胞族(cell lineage)：一个细胞经过分裂、分化后产生的子细胞及母细胞群体，它们之间的遗传特性、形态特征不尽相同，也称为细胞世系、细胞谱系。,一、细胞周期中的神经上皮细胞 1. 细胞周期（cell cycle）：细胞生活周期(cell life cycle)，细胞增殖周期（cell generation cycle） 细胞周期： M期（分裂期mitotic phase, ）： S期（DNA合成期）：细胞急剧合成DNA聚合酶 及4中脱氧核苷酸。 G1期（gap 1 phase）：M期之后与S期之前的 时期。DNA合成前期，合成细胞所需要的结构 蛋白和酶蛋白，为DNA复制准备必要的条件。 G2期（gap 2 phase）：S期之后，又称合成后 期或分裂前期。为细胞分裂准备条件，细胞进 行活跃的RNA和蛋白质合成，并可合成一些 “有丝分裂”因子。,细胞周期的模式图1.连续增殖细胞；2.暂时性不增殖细胞；3.无增殖细胞,2、细胞周期中的神经上皮细胞 神经上皮（neuroepithelium）：神经管上皮，是假复层上皮。 腔面：内界膜 基底面：外界膜 细胞形态：柱状、锥形或梭形。神经上皮细胞具有明显的浆膜，是分离的，不形成合体细胞。 细胞核：位于不同平面；在腔面细胞间彼此以闭锁堤连接,神经管上皮细胞的细胞周期示意图 M期细胞集中于内界膜面；S期细胞集中于外界膜面；G2期细胞迅速下降至主腔面,(内界膜),基底面(外界膜),S带,I带,M带,1）细胞周期中的神经上皮细胞特点 神经管的神经上皮细胞均处于细胞周期的不同时期；核的位置随细胞周期的不同而在内、外界膜之间往返移动。 S期： DNA合成期，细胞集中于外界膜面，细胞开始缩短变 圆，向内界膜移动，细胞核也随之移向内界膜。S期细 胞靠近外界膜聚集成S带。 G2期：时间较短，与邻近细胞的连接消失，细胞迅速下降至 主腔面，细胞核变圆，进入M期。M带与S带之间为中 间带（intermediate zone, I带）M期：分裂期，细胞集中于内界膜面。M期细胞靠近内界膜聚 集成M带。在分裂期，神经上皮细胞不断增殖过程中，细 胞开始进行迁移和分化。M带有丝分裂中期细胞的纺锤体 如与表面垂直，分裂后的一个子细胞即向神经上皮的外周 迁移，并分化为神经母细胞（neuroblast），它们不具备 摄取3H-胸腺嘧啶的能力，也不再分裂，为幼稚的神经元G1期：分裂完成后，细胞间重建连接结构，细胞核再度变长， 移向外界膜，进入S期。M带与S带之间为中间带。,2）细胞周期中的神经上皮细胞三个去向： 继续进入有丝分裂周期。在神经板和早期神经管中的子细胞可再进入有丝分裂周期，失去与管腔基底连接。 不能进入分裂周期的子细胞则迁移进入套层。各种类型的神经元和神经胶质细胞在套层发生分化。a、一些神经元和神经胶质细胞在受适当刺激情况下仍可进入有丝分裂周期；b、另一些神经胶质细胞则暂时离开细胞分裂周期或永久离开细胞分裂周期；神经元是永远离开细胞分裂周期。,3）神经上皮细胞核往返移动的机制 细胞的往返移动表示神经上皮细胞所特有的，也见于各种假复层柱状上皮的胚胎组织。 与微管的活动有关 a.应用细胞分裂抑素（cytochalasin B）可以完 全阻止鸡胚胎神经管核间期细胞的迁移； b.作用于神经上皮细胞顶端，可破坏细胞内微丝及 神经管腔处细胞间的贴附； c.应用秋水仙素可抑制细胞的分裂，从而终止细胞 核的移动。, 与DNA的含量及核大小有关 核的体积在向外运动中增加一倍，向内运动时再增加一倍； 核的DNA含量和核的体积是相对应的。a、早期神经管中，贴近管腔的小核含有多于DNA双倍体的量，所有神经上皮细胞都进入细胞周期； G1期很短，也随着发育的进程逐渐延长，但不同动物G1期的时间差异很大，自数分钟、数小时至数天。在分裂期后，其子细胞可仍停留在G1期，其中一个或两个子细胞也可立即开始DNA合成进入S期，即在外移过程中开始DNA复制。多数神经元永久停留在G1期，神经胶质细胞暂时分布于G1期等待特殊的信号使它们进入新一轮的DNA转录。,b、分裂后DNA合成即开始，并开始向外界膜移动，抵外界膜进入S期；S期较长，历时68h，在一个快速分裂的细胞，S期占细胞周期的1/2。c、核向管腔内界膜移动时，DNA继续复制，神经上皮内1/3细胞核内含有DNA 的4倍量，为G2期，DNA合成后期；G2期历时14h，细胞可永久停留在G2期，并保持4n的DNA含量。d、当核移到管腔内界膜处，进入M期。在M期，细胞分裂为两个子细胞，每个含有2n的DNA。神经上皮细胞的M期通常非常短，一般历时4070min，随着发育的进程，M期逐渐延长。发育中神经管切片上，核分裂数一般不超过2%5%。,神经管上皮细胞的细胞周期示意图 M期细胞集中于内界膜面；S期细胞集中于外界膜面；G2期细胞迅速下降至主腔面,(内界膜),基底面(外界膜),S带,I带,M带,4）大鼠及人脑的细胞周期应用流式细胞计测定大鼠和人脑的细胞周期： 大鼠：大、小脑G2/M期（含即将与正在分裂期的细胞）的细胞峰值在胚18d占测定脑细胞总数的54.3%，以后逐渐降低。出生后G2/M期细胞急剧降低。新生鼠与成年鼠G2/M期细胞数无明显差异。进化过程中出现较晚的大、小脑细胞的G2/M期细胞数明显高于中脑、脑桥、延髓和脊髓。成年大鼠G2/M期细胞数为1.99%。,人：大脑皮质脑细胞G2/M期峰值在胚4月，但G2/M期细胞明显低于大鼠，仅为6.2%，且随发育进程G2/M期细胞数逐渐降低，到成年仍保持在1.0%。a.高度进化的人类脑细胞分裂稍低于啮齿类动物。b.G2/M期细胞中神经胶质细胞是主要的。c.成年动物神经元有无G2/M期分裂相细胞？成年动物脑内神经元，除颗粒细胞外，极少有分裂能力。d.神经元的新生因部位而异，并受遗传、营养、激素以及环境因素的影响。,二、中枢神经系统神经元与神经胶质细胞的起源与分化 （一）神经元和神经胶质细胞的起源是神经系统发育中一个有争议的问题 1. 19世纪末，His（1889）研究人胚脑的神经上皮细胞的分化，提出早期神经管的分裂区存在两种不同的细胞，分别称为生发细胞（germinal matrix cell）和成神经胶质细胞(spongioblast)。生发细胞是具有高度有丝分裂能力的神经上皮细胞，单个存在，体积较小，以后增殖分化成神经元；成神经胶质细胞常多个聚集在一起列成网状，以后分化形成神经胶质细胞。,2. Schaper（1897）提出早期神经管的上皮细胞由单一的细胞类型组成，它们占有整个管壁区域。在细胞间期DNA合成时，细胞呈楔形，其含核部分较宽，位于管壁的表面部分，余下的细胞质部分较细，伸向腔面。待DNA合成后，细胞核逐渐向管腔方向移动。在分裂中期，细胞变成圆形，核大而圆，为未分化型细胞。经过细胞的不断分裂，它即能分化成神经元，又能分化成神经胶质细胞。,3. Fujita等（1963）用H-TdR放射自显影术研究鸡胚神经管的发育时，见到早期神经管上皮只由一种类型的细胞组成。这种细胞不断分裂，先分化为成神经细胞，然后在中间区形成神经元。待神经元分化过程结束后，神经上皮再分裂分化形成神经胶质细胞，再经过迁移过程，在中间去形成神经胶质细胞。实验说明，神经元与神经胶质细胞均由神经上皮的同一种细胞分化形成，只是它们分化的时间不同。先分化的形成神经元，后分化的是神经胶质细胞。,4. Levitt（1981）应用神经胶质原纤维酸性蛋白（glia fibrillary acid protein, GFAP）的免疫组化染色显示猴从受精后38d至出生两个月，其神经管各个部分的上皮可分为两类，即GFAP 阳性和GFAP阴性细胞，而神经元和神经胶质细胞则由这两种不同的前体细胞分化而来。早期神经胶质细胞为放射状胶质细胞（radial glia cell），在猴受精后40d时已经可见到。它的突起很长，如纤维状，贯穿整个神经管壁，一端附着在室区与室下区，另一端呈扇形，扩展分布在软脑膜的下方。,5. 最近，基于组化研究提出中枢神经系统发生的基质细胞理论：该理论认为，中枢神经系统的发生经过3个时期，在第一期中，神经管仅由一种多能干细胞（又称基质细胞）组成。第二期中，经过几次分裂后，基质细胞开始分化为神经元。第二期后，中枢神经系统中的任何类型的神经元均不再有DNA复制。神经元产生结束后，进入第三期。在第三期中，基质细胞分化成为胶质细胞，以后再顺序生成星形胶质细胞、少突胶质细胞、和小胶质细胞。小胶质细胞是中枢神经系统受损后最先起反应的细胞，它在组织剧烈受损时可以逆分化成为胶质细胞。,（二）神经元与神经胶质细胞的起源1. 神经元与神经胶质细胞来自共同的干细胞。干细胞来自胚胎早期的室管膜上皮产生的具有多分化潜能的多潜能干细胞（multipotent stem cell MSC）。将MSC体外培养表明，它可以发生神经元、放射状胶质细胞和星型胶质细胞，也可以是一个星型胶质细胞的祖先细胞产生一群子代星型胶质细胞。2. 干细胞不仅存在胚胎早期，在出生后室管膜下层可长期存在。干细胞在生后存在的功能可能是补充皮质中死亡或损伤的神经细胞。,3. 神经元与神经胶质细胞来自共同的干细胞的实验依据最早发现于视网膜神经元和苗勒氏细胞（神经胶质细胞）的分化。视网膜干细胞在完成多次有丝分裂后，仍具有向神经元和神经胶质细胞分化的能力。4. 脊椎动物的干细胞并非很早就决定了向不同类型神经细胞与神经胶质细胞分化的能力，它具有可塑性，在分裂增殖过程中可受环境因素影响而改变其分化方向。,5. 各组神经元发生的时间各不相同。常在一个相当短的时间完成最后的细胞周期并成为永久的有丝分裂后细胞。神经胶质细胞则相反，与同一脑区的神经元比，它们通过分裂周期的时间要长得多，或者停留在G1期等待适当刺激。6. 在发生的顺序上，一般是大神经元、中等大小神经元，然后是小神经元。如颗粒细胞。在小脑皮质，浦氏细胞最先发生，然后是Golgi细胞、蓝细胞、星型细胞，最后是颗粒细胞。在大脑皮质，锥体细胞最先发生，然后是颗粒细胞。在脊髓，大神经元发生的峰值在小神经元以前。该发生规律几乎适用于所有哺乳类动物及亚哺乳类脊椎动物。,（三）神经元的起源与分化 1. 神经元的起源 神经系统起源于神经外胚层神经管和神经嵴的分化。 在人胚第3周末，胚胎背面正中部外胚层在脊索的诱导下形成神经板，以后发育为神经管。神经板由单层柱状上皮构成，称为神经上皮。当神经管形成后，管壁变为假复层柱状上皮，上皮的基膜较厚称为外界膜（external limiting membrane），靠神经管腔的内表面的一层膜，叫内界膜（internal limiting membrane）。,神经管横切面的模式图,神经管中的细胞周期,中枢神经系统发育的两个时期,A神经管假复层上皮，分裂期,B神经上皮细胞的迁徙三层,1） 神经上皮细胞不断分裂的结果:形成套层（mantle layer）:套层位于神经管的中部。部分细胞分化成神经细胞（neuroblast），迁至神经上皮的外周部迁移到套层的部分细胞起初为圆形，称为无极成神经元（apolar neuroblast）；无极成神经元发生两个突起，称为双极突起成神经元（bipolar neuroblsat）;双极神经元朝向管腔的一侧突起退化消失，成为单极神经元（unipolar neuroblsat）；伸向外界膜一侧的突起迅速增长，形成原始轴突。边缘层（marginal layer）：神经元的轴突伸出套层外，组成边缘层；单极成神经元内侧端又形成若干短突起，成为原始树突，于是成为多极神经元（multipolar neuroblsat）。神经管壁由内向外由神经上皮层、套层和边缘层组成,2）胚胎第4周，神经管的头端膨大发育为脑，其余部分仍保持管状，发育为脊髓。特点：神经元的产生呈现一种“内-外”的层状结构 后发生的神经元迁移时常越过其它早发生神经元，定位于早发生于它的神经元的外部。即，较早分化的神经元位于皮质的深部，新近分化的神经元位于皮层的表层。 神经元的这种“内-外”组装的模式，形成层状结构的特征，特别在大脑皮层、视顶盖和黑质尤为明显。但海马齿状回和小脑皮质的颗粒层是例外。该区域的颗粒细胞不是起源于脑室生发层，而是直接起源于置换的生发层，形成类似“外-内”的模式，在下丘脑和丘脑，神经元的组装确实是依照“外-内”的模式。,2.神经细胞的分化1）神经细胞的分化神经发生(neurogenesis)的过程：神经上皮诱导、增殖、迁移、神经元的分化、突触及神经回路形成。神经细胞的迁移：正在生长的神经细胞的轴突或树突的末端膨大，为生长锥。神经元在最后一次分裂后长出一个或更多的突起，进而分化成高度极化的细胞，生长锥处在这些正伸长的神经突起的引导边缘，它和通向靶区的路径的寻找的靶细胞的识别有关。,生长锥利用微穗（microspike）,即一些微细的突起与周围结构接触，并拉动生长锥前进。机制：生长锥及其突起内含有微丝网，内含有肌动蛋白，具有收缩性，使生长锥和细胞的其余部分产生运动，沿着放射状胶质细胞的突起迁移到其预定的位置。 放射状胶质细胞在引导神经细胞迁移过程中起着决定作用。单个迁移细胞能同时和几条胶质纤维接触，并在不同的放射状胶质纤维束之间交换。当大部分神经细胞完成迁移任务后，放射状胶质细胞即转为星形胶质细胞。,神经细胞分化（differentiation）:由一个前体细胞转变为终末细胞的多步过程。a.神经细胞的分化与其他过程是重叠的，神经上皮不断增殖的过程中细胞即开始进行迁移和分化。b.两栖类胚胎实验研究表明，神经谱系早在卵裂球时即已确定，但神经细胞分化过程中环境因素可在发育的不同时间内起作用，在脊椎动物尤为明显。c.神经细胞的分化形态上的改变，细胞从圆形或卵圆形到有突起，轴突的发生在前，树突的发生在后。如蝗虫在E6d时分化出轴突，E6-12d树突发育并渐渐由简及繁的过程分支，然后，中枢神经系统的一个祖先细胞(pioneer cell)首先发出轴突到临近神经节建立内部联系。,神经细胞形态分化同时的内在变化：神经递质的分化：环境因素对神经递质的分化具重要作用。a.鸡胚第1-7体节水平的神经嵴细胞进入消化管内分化为肌间神经丛与黏膜下丛的副交感神经节细胞，释放乙酰胆碱；b.鸡胚第18-24体节水平的神经嵴细胞进入肾上腺内，分化为髓质的嗜铬细胞，分泌肾上腺素。c.若把该分化为副交感神经节细胞的神经嵴移植于18-24体节水平位置，就会进入肾上腺内，分化为分泌肾上腺素的嗜铬细胞。反之亦然。,结论：神经嵴细胞在递质的产生上具有双重性，环境因素在神经分化中起重要作用；神经胶质细胞、肌细胞及非神经细胞可释放对神经元分化方向起诱导作用的因子，与之以突触相连的其他神经元所引起的兴奋等诸多环境因素，都可以影响甚至改变神经元分化的表型。电生理学变化：发育早期，神经元最初为钙动作电位，此电位可以产生在胞体，也可发生在生长锥；之后变成钠和钙的复合电位。钙离子动作电位在发育早期对生长锥运动的控制是十分重要的。钙离子对于正在发育中的神经元的神经分泌活动、神经介质受体蛋白植入细胞膜以及突触传递等过程均有重要影响。缝隙连接（gap junction）对神经细胞的生长分化具有重要作用。,2）癌基因与神经细胞分化 癌基因（oncogene）在病毒或细胞中存在。在病毒中存在为病毒癌基因(viral cncogene,v-one)，在细胞中存在为细胞癌基因(cellular oncogene,c-onc)，由于它在正常细胞中以非激活形式存在，又称为原癌基因(proto-oncogene)。 癌基因参与机体的发育，对细胞的生长、分化和细胞内信息传递等具重要作用。癌基因在神经细胞分化过程中起正性和负性调节作用。,3.影响神经元数目和大小的因素 成熟期神经元数目是神经发生过程中细胞增殖和死亡平衡的结果 1)测量方法: 组织学技术方法：昆虫 相差显微镜：线虫 单倍体细胞DNA含量：哺乳动物 2)影响因素 基因调控:主要的，但不直接控制最终数量 环境因素:激素、生长因子、营养、环境, 中枢神经系统细胞数及恒定时期： 果蝇：105，蛹期 小鼠脑： 6107 ，出生后 人脑： 1011 ， 不同动物脑发育和成熟时间的差异 有蹄类（猪）：出生时接近成熟动物 啮齿类：大鼠、小鼠：出生时很不成熟 豚鼠：出生时与成年一样 哺乳类：猴、猩猩、人：出生时都不成熟 a.孕期时间的影响？:小鼠19D,大鼠21D,豚鼠68D 人脑出生时的成熟度不如猴,b.孕期温度的影响：对脑细胞数量影响较大 豚鼠：68d,1828d:升高341h，脑重 减少10%；温度破坏生发层细胞，减 低分裂活性，不影响髓鞘形成 鸡：鸡胚CNS对温度变化十分敏感 孵育期57d,37.540.5 ,小脑NC增加22%，35.3 ，小脑NC下降14.6%， 人类：孕妇高烧影响胎儿CNS的发育c.人脑/体重：胚胎3月16%；出生时12%； 1岁10%；20岁2.5%d.神经元大小和数目与动物大小有关 锥体细胞轴突：大动物小动物 4t重大象/4g鼩鼱：体重100万倍；脑重16000倍,3)脑老化时脑重和神经元数目的变化 脑重：人类30岁脑重