xb六、细胞融合与杂交瘤技术.ppt

第六章细胞融合与杂交瘤技术 2 第一节细胞融合技术第二节杂交瘤技术与单克隆抗体的生产 3 第一节细胞融合技术一 细胞融合概述二 细胞融合的基本原理三 细胞融合的常用方法四 融合细胞的筛选 4 1 定义细胞融合 cellfusion 又称体细胞杂交 somatichybridiazation 是指两个或多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程 一 细胞融合概述 5 6 2 发生 自然界存在很多细胞融合现象 如 受精 成肌细胞融合 但频率低 细胞内吞与外排也属细胞膜融合现象 细胞内膜系统物质运输过程等 7 Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞 Virchow于1858年描述了正常组织 发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物 蛙类 的血液细胞发生融合的过程 Cienkawski 1876 Buck 1877 Geddes 1880 在无脊椎动中发现了细胞合并现象 1958年日本学者冈田善雄发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇 PEG 化学融合法 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞 20世纪80年代出现了电融合技术 3 细胞融合研究进展 8 几种细胞融合成功的例子 9 植物融合细胞成长状态对比 右瓶为地面融合的细胞 左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞 10 动物细胞融合实验使用的小白鼠 11 4 细胞融合的分类 基因型相同的细胞融合 形成的双核或多核细胞 称同核体 homokaryon 不同基因型的细胞融合形成的双核或多核细胞 称异核体 杂种细胞 短期死亡 有丝分裂 双亲染色体融合 分裂成二 合核体 synkaryon 也称单核杂种细胞 12 5 细胞融合过程分四个阶段 细胞接触 细胞质膜的融合 细胞质重组 遗传物质的选择 13 植物细胞融合过程 人造小鼠培育过程示意图 14 6 细胞融合的意义 理论上说任何细胞 都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源 这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制 为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统 在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体 线粒体DNA亦可发生重组 从而产生新的核外遗传系统 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备 15 二 细胞融合的基本原理 16 显微镜下细胞融合过程 17 融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解 18 三 细胞融合的常用方法 19 细胞融合技术分类 动物细胞融合细胞细胞融合人为方法构建植物细胞自然融合技术原生质体融合细胞拆合 人为方法 人为组合 20 1 生物法 仙台病毒法 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段 两种细胞在一起培养 加入病毒 在4 条件下病毒附着在细胞膜上 并使两细胞相互凝聚 在37 中 病毒与细胞膜发生反应 细胞膜受到破环 此时需要Ca2 和Mg2 最适pH为8 0一8 2 细胞膜连接部穿通 周边连接部修复 此时需Ca2 和ATP 融合成巨大细胞 仍需ATP 21 用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 22 原理 Kao等认为 由于PEG分子具有轻微的负极性 故可以与具有正极性基团的水 蛋白质和碳水化合物等形成H键 从而在在质膜之间形成分子桥 其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合 另外 PEG能增加类脂膜的流动性 也使细胞的核 细胞器发生融合成为可能 2 化学法 聚乙二醇 PEG 法 23 影响因素 分子量 400 6000 通常 1000 4000 浓度 20 60 通常 30 50 时间 悬浮法1 2min离心法5 8minpH 偏碱为宜 pH7 4 8 0 其他 二甲亚砜 植物血凝素 24 PEG诱导融合的特点 其优点是融合成本低 勿需特殊设备 融合子产生的异核率较高 融合过程不受物种限制 其缺点是融合过程繁琐 PEG可能对细胞有毒害 25 聚乙二醇 PEG 法细胞融合过程 26 27 聚乙二醇 PEG 法细胞融合步骤将两种不同亲本细胞各5 l06混匀 离心沉淀 吸去上清液 加1ml50 PEG溶液 用吸管吹打 使之与细胞接触1分钟 加9ml培养液 离心沉淀 吸去上清液 加5ml培养液 分别接种5个直径60mm平皿 每个平皿加培养液至5ml 37 的CO2培养箱中培养 6 24小时后 换成选择培养液筛选杂交细胞 28 3 电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术 在直流电脉冲的诱导下 细胞膜表面的氧化还原电位发生改变 使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂 进而质膜开始连接 直到闭和成完整的膜 形成融合体 电融合法的优点 融合率高 重复性强 对细胞伤害小 装置精巧 方法简单 可在显微镜下观察或录像观察融合过程 免去PEG诱导后的洗涤过程 诱导过程可控性强 29 电融合的基本过程 细胞膜的接触 细胞在交变电场中极化并沿电力线排列成串 形成细胞间的紧密连接 膜的击穿 在高强度 短时程的直流电脉冲作用下 在其膜上会短暂地形成小孔 从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起 30 31 32 33 甜菜原生质体电融合过程 1 在高频电流电场下的相互接触 2 脉冲刺激后30s3 50秒后4 1 5分钟后5 6分钟后6 15分钟后 原生质体融合完成 34 4 不同细胞融合的条件及其主要应用 35 36 融合后的柑橘 37 融合柑橘与母本比较 38 原理 两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞 筛选的目的是获得优良的杂种细胞 1 亲本2 同核体3 异核体 四 融合细胞的筛选 39 抗药性筛选系统 利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞 如 亲本A 对氨苄青霉素敏感 对卡娜霉素不敏感亲本B 对卡娜霉素敏感 对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 1 动物细胞筛选方式 40 HAT选择系统 HAT是含一定浓度次黄嘌呤 H 氨基喋呤 A 及胸腺嘧啶核苷 T 的一种选择性培养基 其中三种成分与细胞DNA合成有关 DNA合成途径有两种 41 HAT选择培养法 42 营养互补筛选系统 细胞在缺乏一种或几种营养成分时 不能生长繁殖 即营养缺陷型细胞 利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞 如 亲本A 色氨酸缺陷型亲本B 苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养 而亲本细胞均会死亡 43 温度敏感突变型 一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长 但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长 由此筛选杂种细胞 如 亲本一 具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长 亲本二 高温敏感突变型 但不能抗卡娜霉素 杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长 44 荧光激活细胞分选仪 用不同荧光素标记的脂质染料分别处理参与融合的亲本细胞 在激光的激发下 融合细胞能发射两种荧光 由此筛选杂种细胞 如 亲本一 用RB200标记 发明亮橙色荧光 亲本二 用FITC标记 发黄绿色荧光 杂种细胞能发射两种荧光 45 46 2 杂交细胞表型及其控制 杂交细胞的遗传表型具有多样性 双亲特征都有 且植物细胞能与动物细胞杂交 和不稳定性 染色体排斥 基因丢失 可以用来进行基因定位 狭义的杂交细胞遗传表型的控制 是指基于对杂交细胞的基因型和 或 表型动态分析的基础上 使有利用价值或人们关注的表型得到维持的措施 47 杂交细胞遗传表型的控制过程 遗传表型的动态观察和定期分析 核型与带型 建立种子细胞库 定期传代分种 避免细胞过度生长稳定的染色体数 或倍性 个数变化 与带型 能有稳定的产物 48 第二节杂交瘤技术与单克隆抗体的生产一 基本概念二 杂交瘤技术的基本原理三 单克隆抗体的特性四 杂交瘤细胞的制备五 单克隆抗体的应用 49 50 抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质 抗体分子 由四条肽链所组成 两条重链 H链 两条轻链 L链 结合区 抗体分子上有两个抗原结合区可变区 V区 稳定区 C区 51 抗体的结构与功能 52 一 基本概念 杂交瘤细胞 是指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细胞 它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力 又具有参与融合的体细胞的一些特征 53 杂交瘤技术 hydridomatechnique 也称MAb制备技术 是指建立杂交瘤细胞系的技术 通常指B细胞杂交瘤技术 即将骨髓瘤细胞与B细胞融合 以建立能分泌特定的均质抗体 54 MAb 系指由一个B细胞克隆产生的 只识别某一特定抗原决定簇的均质抗体 克隆 cloning 指无性繁殖系 也指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖形成的细胞集落 55 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞 myelomacell 与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞 antigenstimulatedBlymphoblast 融合得到杂交瘤细胞 hybridomacell 杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖 又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力 因此 单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术 hybridomatechnology 56 NielsK Jerne G Kohler C Milstein 57 淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说 即一种克隆只产生一种抗体 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞 并进行克隆化 然后大量培养增殖 制备所需的McAb 二 杂交瘤技术的基本原理 58 三 单克隆抗体的特性 与多克隆抗体 PcAb polyclonalantibody 相比 MAb具有以下显著特点 高度均质性 结构 亲和力 亲合力相同 高度特异性 单一抗原决定簇 不发生交叉反应 高效价 ELISA 酶联免疫吸附测定法 效价达到10 6 10 8 来源稳定 可大量生产 容易标准化 59 周期长 技术性要求强 制备MAb涉及一系列实验技术方法及试剂的选择 包括抗原 免疫动物 免疫方案 筛选检测抗体的方法 骨髓瘤细胞 饲养细胞 血清 融合剂 细胞融合方案 杂交瘤细胞克隆化 细胞的扩大培养和冻存等 四 杂交瘤细胞的制备 60 单抗的制备过程 动物免疫与亲本细胞的选择细胞融合 淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤细胞的筛选 有限稀释法等单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的纯化 61 1 亲本细胞的选择 骨髓瘤细胞 一般不分泌抗体 能在体外无限繁殖和连续继代培养 且为HGPRT 或TK 多用BALB C小鼠的骨髓瘤细胞 62 抗体生成细胞 经过免疫处理的淋巴细胞 多用大鼠或小鼠 免疫方法 体内法或体外法 体内法 对细胞或微生物抗原可直接注射入小鼠体内 可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后 注入到动物体内 3 4天后 在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液 存活率在95 以上的可以用于融合 体外法 直接提取大 小鼠淋巴细胞 调整为107个 ml 加适当浓度抗原 3 4天后 收集被刺激的淋巴细胞 63 2 细胞融合 将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2 1或10 1的比例混匀于50ml锥形离心管内 1200rpm离心7 10分钟 尽量吸净上清液 用手指轻击管壁 使管底沉淀的细胞铺展成薄层 在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入40 50 的PEG0 5ml 随后静置90秒 再于5分钟内边振摇边逐滴加入5 10ml不含血清的培养液或盐水缓冲液 以终止PEG的作用 再静置10分钟 64 3 HAT培养基筛选杂交瘤细胞 细胞团块分散后 加HAT溶液 稀释至骨髓瘤细胞不超过2 105ml 即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0 1ml 如是24孔板 每孔0 5ml 总量分别为0 2ml和1ml 用HAT选择性培养时每隔2 3天 半量换液 7天后可以选择出杂交瘤细胞 65 细胞融合的选择示意图 66 杂交瘤技术中 常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷 HPRT 的骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 TK 骨髓瘤细胞为亲本之一 HPRT 细胞的嘌呤只能由主要途径产生 TK 细胞的嘧啶只能由主要途径合成 含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的主要途径 67 嘌呤合成通路的阻断 68 淋巴细胞具有合成DNA的两条途径 杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因 可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷 通过主要途径合成DNA 在HAT培养基中 HPRT 或TK 亲本细胞死亡 淋巴细胞亦逐渐死亡 只有杂种细胞存活 69 特异性杂交瘤细胞的筛选 通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞 仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞 可取上清液 根据抗原的性质 抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择 可溶性抗原可采用放射免疫 酶联免疫吸附测定 ELISA 间接血凝等方法测定 细胞抗原可采用免疫荧光 51Cr释放试验 溶血空斑测定 补体依赖的细胞毒等方法直接测定针对这些抗原的抗体 70 利用培养基对单抗进行鉴定的过程 71 4 杂交瘤细胞的克隆化培养 利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系 在培养过程中 一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞 如小鼠的腹腔巨噬细胞 脾细胞或胸腺细胞等 方法有有限稀释法 软琼脂培养法 显微操作法 应用荧光激活分选仪等 72 有限稀释法 通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的1 取出阳性孔内的细胞进行计数2 用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞 3 如果在96孔板内每孔加0 1ml 其机率将为每孔内落入一个细胞 4 加入一定数量的饲养细胞 经过8 12天后 可观察到有集落生长的孔 5 根据检测的阳性结果再次进行克隆化 73 软琼脂培养法 在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0 5 的琼脂 待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0 25 的软琼脂 待细胞长成集落后 用毛细管吸出移种于含饲养细胞的9