北医免疫课程PDCD5研究思路

1,PDCD5的发现和功能研究北京大学医学部 马大龙,2,前言,“Life cannot exist without death”；每个人每天有5千万到7千万个细胞死亡。细胞凋亡（Apoptosis）是程序化细胞死亡（Programmed cell death,PCD）的一种形式，在细胞分化、增殖、生长和疾病中起着重要的作用。如果机体缺乏凋亡，一个80岁的老人将有2吨重的骨髓和淋巴节，16公里长的肠道（Nature,412:23,2001）.,3,凋亡缺陷导致的疾病： 肿瘤、多发性硬化症凋亡过强导致的疾病： AIDS、中风、神经退行性疾病、脊髓损伤等凋亡失调导致疾病： 类风湿关节炎、SLE、糖尿病等,4,研究思路的提出,细胞凋亡过程中，将有一些基因表达改变，特别是上调表达基因，可能发挥重要的凋亡调节作用。,5,本项研究从1995年开始启动,利用cDNA-RDA（Representative Differences Analysis）技术, 从诱导凋亡的TF-1细胞克隆了凋亡上调表达的人类新基因, 其中之一命名为TFAR19 (TF-1 apoptosis related gene)1998年申请专利，1999年在BBRC杂志发表论文2001年国际基因命名委员会将该基因统一命名为PDCD5 (Program Cell Death 5)迄今有关PDCD5研究的国内外论文超过200篇， PUBMED检索115篇PDCD5论文；中国知网(CNKI)检索136篇论文,6,正常培养的TF-1细胞(Driver),进入凋亡的TF-1细胞(Tester),三轮cDNA-RDA,DNA测序和基因库检索,用Slot Blots和Northern Blots检测表达的差异,RACE方法克隆PDCD5的全长序列,PDCD5在E.coli中的表达、纯化,PDCD5真核表达载体的构建,PDCD5的胞内定位,抗体制备和免疫检测,PDCD5蛋白质的活性研究,PDCD5转染的活性研究,PDCD5在组织和细胞中表达检测,7,PDCD5/TFAR19的Northern blots分子杂交结果,Left is RNA from normal-cultured TF-1 cellRight is RNA from TF-1 cell undergoing apoptosis,8,Sequence of PDCD5 cDNA,CTG CTC CAG CGC TGA CGC CGA GCC ATG GCG GAC GAG GAG CTT GAG GCG CTG AGG AGA CAG AGG CTG GCC GAG CTG CAG GCC AAA CAC GGG 90 MET Ala Asp Glu Glu Leu Glu Ala Leu Arg Arg Gln Arg Leu Ala Glu Leu Gln Ala Lys His Gly GAT CCT GGT GAT GCG GCC CAA CAG GAA GCA AAG CAC AGG GAA GCA GAA ATG AGA AAC AGT ATC TTA GCC CAA GTT CTG GAT CAG TCG GCC 180 Asp Pro Gly Asp Ala Ala Gln Gln Glu Ala Lys His Arg Glu Ala Glu MET Arg Asn Ser Ile Leu Ala Gln Val Leu Asp Gln Ser Ala CGG GCC AGG TTA AGT AAC TTA GCA CTT GTA AAG CCT GAA AAA ACT AAA GCA GTA GAG AAT TAC CTT ATA CAG ATG GCA AGA TAT GGA CAA 270 Arg Ala Arg Leu Ser Asn Leu Ala Leu Val Lys Pro Glu Lys Thr Lys Ala Val Glu Asn Tyr Leu Ile Gln MET Ala Arg Tyr Gly Gln CTA AGT GAG AAG GTA TCA GAA CAA GGT TTA ATA GAA ATC CTT AAA AAA GTA AGC CAA CAA ACA GAA AAG ACA ACA ACA GTG AAA TTC AAC 360 Leu Ser Glu Lys Val Ser Glu Gln Gly Leu Ile Glu Ile Leu Lys Lys Val Ser Gln Gln Thr Glu Lys Thr Thr Thr Val Lys Phe Asn AGA AGA AAA GTA ATG GAC TCT GAT GAA GAT GAC GAT TAT TGA ACT ACA AGT GCT CAC AGA CTA GAA CTT AAC GGA ACA AGT CTA GGA CAG 450 Arg Arg Lys Val MET Asp Ser Asp Glu Asp Asp Asp Tyr Stop AAG TTA AGA TCT GAT TAT TTA CTT TGT TTA TTG TCT ATA GCC TTT TAA AAA AAT AAA CTT GTT ATG CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 540 AAA AAA AAA AAA AAA AAA,PDCD5编码蛋白结构比较简单,全长125个氨基酸，不含二硫键， pI 5.65 ;无信号肽，无跨膜序列，与已知人类蛋白无同源性;S118可以被CK2磷酸化,9,PDCD5基因结构图,（染色体19q12-q13.1）,cDNA,867bp,2718bp,804bp,950bp,323bp,Exon1(90bp),ATG,TGA,Exon2(38bp),Exon3(62bp),Exon4(92bp),Exon5(72bp),Exon6(167bp),基因组DNA,558bp，编码125个氨基酸,10,PDCD5蛋白在不同种属中序列高度保守,11,11,PDCD5 蛋白结构,（PDB ID: 2CRU，by Nagashima T, et al）含双链DNA结合Domain；C端 RuvA-like区域,12,如何开展基因功能研究,构建真核表达质粒，转染细胞，通过基因过表达（Overexpression）研究基因功能。构建绿色荧光蛋白表达质粒，观察细胞定位。表达重组蛋白，观察其对细胞的影响。利用RNA干扰或反义寡核苷酸封闭基因的表达,分析基因的生理功能动物体内功能研究：转基因和基因敲除,13,pGEM-TTFAR19,EcoR I,EcoR I,LacZ,fi ori,ori,TFAR19,AmpR,EcoR I,T4 Ligase,Construction of pcDITFAR19,14,PDCD5过表达促进 HeLa和 MGC-803 细胞撤除血清诱导的凋亡,15,15,PDCD5对各种细胞具有促凋亡效应,但单独不能诱导凋亡,16,SV40 poly A,pEGFP-C3,CMV IE,NeoR,EGFP,EcoR I,Sal I,AmpR,Sma I,BamH l,SV40 poly A,pEGFPC3PDCD5,CMV IE,NeoR,EGFP,BamH I,TFAR19,AmpR,Sma I,BamH l,Sma I,MCS,Tfar19 PCR Product,BamH I,Sma I,Xho I,Xho I,Klenow,Sal I,EcoR I,Klenow,T4 Ligase,Construction of expression vector of pEGFPC3-TFAR19,17,PDCD5蛋白主要定位在细胞核,Green Fluorescein Protein staining (488nm),DAPI staining (DAPI wave length),18,VP16诱导HeLa细胞凋亡后PDCD5出现核转位现象,0 hour 30min,2 hours 8 hours,19,细胞因子撤除诱导TF-1细胞凋亡后促进PDCD5核转位,A: Cells were stained with FITC-labeled 3A3 antibody at different time points,and observed using CLSM. B: Cells were cultured in GM-CSF-free medium for 16h, then stainedwith FITC-3A3 and DAPI. Nuclear accumulation of PDCD5 and condensed nuclei were obviouslyobserved.,Yingyu Chen（陈英玉） et al:Nuclear translocation of PDCD5 (TFAR19): an early signal for apoptosis? FEBS Letter，2001，509: 191,20,pL,pMTY-4,AmpR,Xho I,Stu I,Thrombin Linker,MS2,EcoR I,Pst I,PDCD5 ORF PCR Product (410bp),pL,pMTY-TFAR19,AmpR,Xho I,Thrombin Linker,MS2,EcoR I,Pst I,TRAF19,Sma I,Bgl I,Xho I,Xho I,Stu I,Klenow,Xho I,T4 Ligase,构建PDCD5原核表达载体pMTY4-TFAR19,21,在大肠杆菌表达和纯化重组PDCD5蛋白,M. protein marker from Promega 1. uninduced whole bacteria 2. induced whole bacteria 3. cut after thrombin 4. purified PDCD5 protein,22,Western Blot证明PDCD5蛋白在凋亡TF-1细胞上调表达,Left is protein from apoptotic TF-1 cellsRight is protein from normally- cultured TF-1 cells,23,重组PDCD5蛋白能够促进肿瘤细胞撤除血清诱导的凋亡,24,重组蛋白PDCD5能够明显抑制IDR诱导的K562细胞的克隆形成数目,25,25,细胞核蛋白PDCD5具有穿膜效应,人PDCD5蛋白可以通过细胞膜的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG) 途径从细胞外转运到细胞内，109-115氨基酸是其活性功能区。PDCD5的穿膜效应提示其可以作为重组蛋白药物发挥促进肿瘤治疗效应Ying Wang（王应） et al：Cellular uptake of exogenous human PDCD5 protein. J Biol Chem, 2006, 281(34) :24803-24817,26,荧光标记PDCD5蛋白的细胞内转运作用,27,p53N-PDCD5融合蛋白诱导细胞凋亡,28,如何封闭PDCD5的功能？,PDCD5单克隆抗体的细胞内导入PDCD5反义寡核苷酸PDCD5反义RNA表达质粒PDCD5 RNA干扰,29,Rui M（芮珉）,et al, Transfer of anti-TFAR19 monoclonal antibody into HeLa cells by in situ electroporation can inhibit the apoptosis.Life Science，2002 Aug 30;71(15):1771-8.,抗PDCD5单克隆抗体细胞内导入抑制 VP16诱导的 HeLa 细胞凋亡,30,The targeting sequences of PDCD5 siRNAs,31,PDCD5 siRNA 的抑制表达作用,pGC-Non-silencing,pGC-siPDCD5,A.,Non-silencing siRNA,siPDCD5,B.,C.,32,siPDCD5 抑制凋亡基因Bax转染诱导的细胞凋亡,33,siPDCD5抑制procaspase-3的切割和caspase-3活性,Chen L（陈丽娜）,et al:Short interfering RNA against the PDCD5 attenuates cell apoptosis and caspase-3 activity induced by Bax overexpression.Apoptosis. 2006, 11(1):101-111,34,34,PDCD5小鼠体内功能研究,PDCD5基因敲除小鼠胚胎致死。,PDCD5 +/+,PDCD5-/-,E13.5d.,PDCD5 +/+,PDCD5-/-,E11.5d.,PDCD5转基因小鼠出现凋亡细胞数量增加，抵抗化学致癌剂诱导的皮肤肿瘤发生；意外发现免疫系统改变，调节性T细胞（Treg）比例增加，小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发病减轻。,35,36,36,PDCD5转基因小鼠凋亡细胞明显增加,Li,Y et al:Transgenic human programmed cell death 5 expression in mice suppresses skin cancer development by enhancing apoptosis.Life Sci. 2013, 92(24-26):1208-14,37,37,PDCD5转基因小鼠对3-MC诱导的皮肤癌具有抑制作用,38,PDCD5转基因小鼠脾脏和胸腺nTreg细胞增加,Xiao,J（肖娟） et al: PDCD5 negatively regulates autoimmunity by upregulating FOXP3+ regulatory T cells and suppressing Th17 and Th1 responses. J Autoimmunity.2013 Dec;47:34-44,39,39,A,B,C,PDCD5转基因小鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎发病减轻,40,分子机制研究,Pulldown 、Co-IP？、ELISA实验证明PDCD5结合Caspase-3，促进Caspase-3的稳定性（孙荣华博士论文，李现亭博士论文）.,ELISA for PDCD5-Caspase3 interaction,41,PDCD5对caspase-3 稳定性的影响(in vitro),42,42,42,Nuclear translocation,?,+,+,43,43,德国Stelzl等2005年利用规模化酵母双杂交发现PDCD5结合TIP60 （组蛋白乙酰转移酶, ）、EEF1（翻译延伸因子）、RIF1（酵母端粒蛋白同源分子）、ACP5（酸性磷酸酶）Stelzl U et al: A human protein-protein interaction network: a resource for annotating the proteome. Cell. 2005, 122(6):957-68,PDCD5在细胞核如何发挥作用？,44,本实验室证明PDCD5结合TIP60，促进组蛋白乙酰化,Xu LJ（许兰俊） et al:PDCD5 interacts with Tip60 and functions as a cooperator in acetyltransferase activity and DNA damage-induced apoptosis.Neoplasia, 2009, 4:345-354,45,45,TIP60是一种重要的乙酰转移酶，促进组蛋白、P53和FOXP3等分子的乙酰化修饰，参与基因转录、细胞凋亡、DNA损伤修复及免疫调节功能。,46,46,PDCD5直接与p53结合，是p53的正调节因子,Xu L(许兰俊）,et al:PDCD5 interacts with p53 and functions as a positive regulator in the p53 pathway. Apoptosis. 2012 Nov;17(11):1235-45.,47,47,PDCD5促进FOXP3乙酰化并增加FOXP3蛋白稳定性,Xiao,J（肖娟） et al: PDCD5 negatively regulates autoimmunity by upregulating FOXP3+ regulatory T cells and suppressing Th17 and Th1 responses. J Autoimmunity.2013, Sep 5.Epub ahead of print,与PDCD5结合的其他分子(1),NF-B p65结合PDCD5基因启动子区，促进PDCD5表达，促进凋亡(Murshed F et al, Apoptosis, 2014 Mar;19(3):506-17)。,48,与PDCD5结合的其他分子(2),分子伴侣CCT结合PDCD5蛋白，抑制-tubulin折叠，促进凋亡（Tracy CM et al,JBC, 2014 Feb 14;289:4490-502),49,与PDCD5结合的其他分子(3),肿瘤抑制蛋白pVHL结合PDCD5，促进MDM2降解，从而促进p53的稳定性，促进凋亡（Essers PB et al,Oncogene. 2014 Jan 27.Epub ahead of print）。,50,51,51,PDCD5,FOXP3,Active caspase-3,Nuclear translocation,TIP60,Histone,P53,Apoptosis,Acetylation,?,Acetylation,PDCD5的分子作用机制,Immune regulation,Acetylation,CCT,-tubulin,inhibit,pVHL,Apoptosis,Apoptosis,52,52,PDCD5从基础到临床,在疾病时情况下的是否表达异常？遗传变异是否影响疾病易感性？有无临床诊断价值（Biomarker)？是否有治疗价值？,53,PDCD5 mRNA 在不同人类正常组织中的表达,54,54,PDCD5在肿瘤中下调表达,1。肝癌（PNAS， Int J Oncol,中国普通外科杂志） 2。乳腺癌（NEJM）3。白血病（北医学报，Leukemia Res）4。子宫颈癌（北医学报）5。口腔鳞癌（北医学报）6。卵巢上皮癌（中国妇产科临床杂志）；囊腺癌预后相关（Oncol Rep）7。甲状腺乳头状癌（中华内科杂志）8。胃癌，预后相关（Apoptosis）9。肺癌（J Clin Oncol ）10.肾透明细胞癌，预后相关（南方医科大学学报）11。脑星型胶质瘤（Oncol Rep）12。多发性骨髓瘤（中南大学学报）13.骨肉瘤（Apoptosis），预后相关（J Surg Oncol）14.前列腺癌（Chin Med Sci J）15.蕈样肉芽肿（山东医科大学学报）16.喉鳞状细胞癌(J Int Med Res),55,PDCD5的表达与肾癌预后相关,谭万龙，等：肾透明细胞癌PDCD5表达及与预后的关系.南方医科大学学报，2006，26(9)：1316-1318,56,PDCD5的表达与胃癌预后相关,Yang YH,et al:Expression of programmed cell death 5 gene involves in regulationOf apoptosis in gastric tumor cells.Apoptosis. 2006 Jun;11(6):993-1001.,57,PDCD5的表达与骨肉瘤预后相关,Chen C,et al:Prognostic significance of downregulated expression of programmed cell death 5 in chondrosarcoma.J Surg Oncol. 2010 Dec 1;102(7):838-43.,58,58,1。系统性红斑狼疮表达上调（中华风湿病学杂志）2。老年性白内障表达上调（眼科研究）3。骨关节炎表达上调（Apoptosis,Acta Pharmacol Sin）4。桥本病甲状腺表达上调（中华内分泌代谢杂志）5。多囊卵巢综合征表达上调（北京大学学报医学版）6. 类风湿关节炎病人的关节和滑膜细胞表达下调（Apoptosis）7. 狼疮性肾炎病人肾小管表达下调（临床儿科杂志）8. 银屑病患者皮损表皮细胞表达下调（中华皮科杂志）9. 支气管哮喘病人血清PDCD5含量上调（中华医学杂志）10.肝损伤病人血清PDCD5水平上升（J Immunoassay Immunochem）11.脓毒血症病人血清PDCD5水平上升（北京大学学报医学版）12.大骨节病（Kashin-Beck病)关节软骨表达上调（Chin. Sci. Bull）,PDCD5在其他疾病中的异常表达,59,59,脓毒血症病人血清PDCD5水平明显上升(ELISA检测）,刘慧琳等：脓毒症患者中血清程序化细胞死亡因子5水平的变化。北京大学学报医学版，2013，45：238,60,ELISA试剂盒检测自身免疫病病人血清PDCD5水平增加,李婉红，等：凋亡基因PDCD5及抗核抗体谱在自身免疫病中的表达。中国卫生检验杂志， 2012 ，22 （5 ）：1044,61,61,PDCD5的遗传多态性与白血病相关,PDCD5启动子区存在2个连锁不平衡的SNPs：-11G/-27A or -11A/-27G前者比后者明显高表达PDCD5白血病患者的杂合子频率明显高于正常人, 25.58% vs 11.85,Xi Ma(马曦）, Guorui Ruan（阮国瑞）, et al: Two single-nucleotide polymorphisms with linkage disequilibrium in the human PDCD5 gene 5 regulatory region affect promoter activity and the susceptibility of CML in Chinese population. Clin.Cancer.Res. 2005, 11: 8592 - 8599,62,PDCD5 5调控区两个新SNP的发现,SNPs的筛选：45个样本直接测序（-11位和-27位同时出现SNP）,63,PDCD5 SNP在HeLa细胞的启动子活性,64,PDCD5 SNP影响HeLa撤血清诱导细胞凋亡的启动子活性,65,PDCD5启动子区SNP的CML基因型频率,Heterozygous ratio: 25.58% 、11.85,66,PDCD5 SNPs 在AML患者中的研究,67,RQ-PCR检测不同基因型CML患者PDCD5的mRNA水平,68,69,Spinola等通过SNPs全基因组扫描技术，发现PDCD5基因上游35kb处的SNP与肺癌发病相关，GG或CG基因型携带者肺癌发病风险升高；肺腺癌组织中PDCD5的mRNA比正常肺组织低2.4倍。超表达该基因的人NCI-H520细胞系克隆形成能力明显下降。作者认为PDCD5可能是新的抑癌基因,Spinola M,et al:Association of the PDCD5 locus with lung cancer risk and prognosis in smokers.J Clin Oncol，2006, 24(11):1672-8.,PDCD5的遗传多态性与肺癌相关,70,70,PDCD5在肿瘤治疗中的应用,PDCD5腺病毒或重组蛋白有可能作为放化疗的增敏剂，提高亚适剂量化学药物的抗肿瘤疗效，降低其对毒性，产生协同效应，具有潜在的临床意义。,71,PDCD5腺病毒在裸鼠体内对K562细胞的化疗增敏效应,Ruan GR（阮国瑞),et al:Adenovirus-mediated PDCD5 gene transfer sensitizes K562 cells to apoptosis induced by idarubicin in vitro and in vivo.Apoptosis. 2008，13:641,72,单纯化疗药IDR的抑瘤率达60.27%时，IDR联合PDCD5抑瘤率可达92.03,裸鼠瘤内注射PDCD5重组蛋白增加K562细胞对IDR的敏感性,Shi L（史琳）, et al:Potent antitumor activities of recombinant human PDCD5 protein in combination with chemotherapy drugs in K562 BBRC. 2010 ,;96(2):224-30,73,裸鼠腹腔注射PDCD5重组蛋白增加K562细胞对IDR的敏感性：平均瘤块57.7mm3开始治疗,74,重组PDCD5腹腔注射联合IDR治疗实验各组小鼠移植瘤重量,*同单独化疗药相比，差异具有统计学意义， P0.05；*同单独化疗药相比，差异具有统计学