7章免疫学技术在食品科学中的应用

第七章 免疫学检测技术,免疫学检测技术以其灵敏度高、专一性强和速度快等显著特点广泛用于食品的品质、质量、安全以及食品中生物活性成分的检测与分析。,第一节 抗原抗体的检测,一.抗原抗体反应,指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应，是免疫球蛋白分子上的抗原结合位和抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与下发生的反应。抗原抗体反应可发生于体内，也可发生于体外。,抗原,抗体,抗原与抗体之间通过非共价键结合，它们之间的结合力包括电荷引力、范德华力、氢键结合力和疏水作用力。多种非共价结合力使抗原抗体紧密结合在一起。,抗原与抗体结合力,抗原与抗体反应特点,抗原,抗体,1、特异性：抗原抗体在化学结构和空间构型上呈互补关系，两者结合具有高度特异性。2、按比性：两者分子比例合适时才出现最强的反应。3、可逆性：改变pH和离子强度是最常用的促解离方法。,抗原与抗体反应的影响因素,1）抗原抗体性质：互补程度2）酸碱度：pH 6-8 温度：37 度电解质：0.85%氯化钠或各种缓冲液,二.利用抗原抗体反应的实验,主要用途：用已知的抗体检测未知的抗原。用已知的抗原检测未知的抗体。 定性或定量检测体内各种大分子，如：细胞因子，免疫球蛋白。,二.利用抗原抗体反应的实验,免疫凝集试验 免疫沉淀反应 免疫标记技术其他,1.免疫凝集试验,颗粒抗原(例；细菌、红细胞）或可溶性抗原结合于不容性载体微粒上后与相应的抗体在适当的条件下，经一定时间后凝集成肉眼可见的凝集物。,直接凝集反应,间接凝集反应,免疫凝集反应,颗粒抗原,相应抗体,直接凝集反应,颗粒抗原(例；细菌、红细胞）与相应的抗体直接结合所出现的凝集现象称为直接凝集反应。,直接凝集反应,肉眼可见的凝集物,直接凝集试验,试管法,玻片法,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应的抗体(或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。载体：人或动物的红细胞、活性碳颗粒、聚苯乙烯胶乳等。载体增大抗原（或抗体）反应面积。,间接凝集反应,可溶性抗原,不容性载体,相应抗体,正向间接凝集反应,可溶性抗体,不容性载体,可溶性相应抗原,反向间接凝集反应,2.免疫沉淀反应,免疫沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原（细菌培养液、细胞或组织浸出液、血清蛋白等）与相应抗体特异结合后，在电解质参与下出现的沉淀现象。该反应多用于半固体琼脂作为介质，抗原抗体在凝胶中扩散，在比例合适处形成白色沉淀。,单向免疫扩散,单向免疫扩散（single immunodiffusion)将一定量的已知抗体均匀混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后加入抗原。孔内抗原向四周呈环状形成浓度梯度，在抗原与抗体的量达到一定比例时即可形成肉眼可见的沉淀环。,抗原,抗体,双向免疫扩散,双向琼脂扩散（double immunodiffuse test)可溶性抗原和抗体在含有电解质的同一个琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周凝胶中扩散，如果两者相对应，则发生特异性反应，在浓度比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原的相关性分析。,常用于食品安全检测，对食品中污染病源菌的定性和监别，以及食品中的某些成分。如：单向免疫扩散法检测牛乳中免疫球蛋白含量。,免疫沉淀试验应用,3.免疫标记技术,免疫标记技术immunolabelling technique 指用荧光素，放射性核素，酶、化学发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。具有灵敏度和特异性高，快速，可定性、定量等检测。,免疫标记技术分类,酶标记免疫学分析EIA放射线标记免疫学分析RIA免疫荧光法IF,酶标记免疫学技术,将酶催化作用的高效性与抗原抗体的特异性相结合的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体后形成的酶标记物，既保留抗原或抗体的免疫活性，又保留了酶的催化活性。当酶标记物与待测标本中相应的抗原或抗体相互作用时，可形成酶标记抗原抗体复合物。利用复合物上标记的酶催化底物显色，其颜色的深浅与待测标本中抗原或抗体的量相关。 灵敏度：ng-pg, 常用酶:辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶,酶标记免疫学技术,酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)免疫印迹技术(Immuno-blotting)酶免疫组化技术（enzyme immunohistochemistry technique)其它,ELISA :enzyme linked immunosorbent assay 将已知抗体（抗原）包被于载体上，再加上抗原-抗体反应使酶标记抗体（抗原）结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。,酶联免疫吸附试验（ELISA),酶联免疫吸附试验（ELISA),间接法双抗体夹心法竞争法,酶联免疫吸附试验（ELISA),间接法,抗原,抗体一抗,二抗,底物,产物,酶联免疫吸附试验（ELISA),双抗体夹心法（三明治),抗原,抗体,酶标抗体,底物,产物,酶联免疫吸附试验（ELISA),竞争法,E,E,E,E,E,E,E,E,E,E,E,E,测定,对照,抗原,底物,产物,抗体,E,酶标抗原,ELISA广泛应用于食品科学领域。,食品中农药残留检测食品中抗生素残留检测食源性病原菌检测,食品安全检测,食品成分提取,功能性食品研究,免疫印迹技术(Immuno-blotting),将凝胶电泳的高分辨力同固相免疫测定结合起来的一种方法。先将复合物在分离胶中分离，然后将这些分子转移至膜上，再用特异性的抗体来鉴定这些单个的抗原成分。,免疫印迹技术(Immuno-blotting),SDS-PAGE 蛋白质转印 酶免疫测定,可应用于蛋白质提取及分析等许多方面。,三项技术结合而成。,免疫印迹技术(Immuno-blotting),CBB,Immunoblotting,LWPC,LWPC,酶免疫组化技术,以酶标抗体与组织或细胞的抗原进行反应，结合形态学检查，对抗原进行定性、定量或定位检测的技术。用于测定组织或细胞表面的抗原。,3.免疫标记技术,酶标记免疫学分析EIA放射线标记免疫学分析RIA免疫荧光法IF,放射线标记免疫学分析RIA,用放射性同位素标记抗原或抗体进行免疫学检测的免疫标记技术。该法灵敏度高达pg。常用的放射性同位素有125I 和 131I。 应用于食品安全检测，食品中农药残留、激素等检测。,免疫荧光法IF,直接法荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。,特异性强，但任一抗原均需制备荧光素抗体,间接法用第一抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。灵敏度高、荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光增多。,第二节 淋巴细胞的测定,测定淋巴细胞的功能，可以判断机体的细胞免疫或体液免疫水平。 测定淋巴细胞功能试验应用于功能性食品等研究中。,T淋巴细胞增殖试验,T细胞功能测定,细胞毒试验,T淋巴细胞增殖试验,T淋巴细胞在有丝分裂原或抗原刺激下可转化为淋巴母细胞，产生一系列形态变化。细胞变大、细胞浆增多、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等。,T淋巴细胞增殖试验,形态学方法-镜检淋巴母细胞3H-TdR掺入法氚标记胸腺嘧啶核苷（Thymidine ribosode)渗入法。测定DNA增殖的量(也可用于测NK细胞活性)MTT比色法细胞活化增殖水平（可溶性噻唑盐，代谢后产生兰紫色物）,T淋巴细胞增殖试验,T淋巴细胞增殖试验,根据形态结构，计算淋巴细胞转化率，即淋巴母细胞的含量,形态学方法,淋巴细胞转化过程中，细胞DNA合成大量增多。在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ），使3H-TdR渗入到DNA中，根据细胞内核素的量可判断淋巴细胞转化程度。,3H-TdR掺入法,MTT比色法,MTT是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝紫色甲瓒沉积于细胞内或细胞周围，形成的甲瓒的量与细胞活化增殖的程度成正相关。,细胞毒试验,细胞毒试验,乳酸脱氢酶法,细胞凋亡检查法,乳酸脱氢酶法LDH在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡的数目成正比，用比色法测定。,乳酸脱氢酶法,细胞凋亡检查法靶细胞被CTL杀伤后，可发生细胞凋亡。方法有形态学法、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等。,细胞凋亡检查法,B细胞功能测定,B细胞的数目和功能测定是反应机体体液免疫水平的重要指标。,抗体形成细胞试验,用绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与高浓度的SRBC混合后加入琼脂糖凝胶中，其中每个释放溶血性抗体的细胞可致敏其周围的SRBC ，在补体参与下，抗体形成细胞周围SRBC溶解，在其周围形成一个肉眼可见的空斑。一个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑数量反应机体的体液免疫功能。,举 例,增强免疫力的功能性食品的研究,1.乳果糖低聚体促进肠粘膜IgA的分泌2.具有促进IgA产生的食用蘑菇的探索3.LF、b-LG增强淋巴细胞