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实验五 宫颈癌HeLa细胞株培养,二、培养基的配制,一、实验目的,熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。,二、实验原理,组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。,三、仪器、材料和试剂,超净工作台微孔过滤器（0.22um）高压灭菌锅蒸馏水器磁力搅拌器天平超低温冰箱二氧化碳培养箱,（一）仪器,（二）用具、材料,细胞培养瓶微量加样器250ml和125ml试剂瓶、量筒、离心管pH试纸培养细胞,（三）试剂,HCl、 NaOH、 酚红RPMI 1640干粉小牛血清、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺NaHCO3 、胰酶三蒸水,四、实验步骤,（一）准备(清洗与灭菌）,（二）合成培养基（RPMI 1640 ）的配制,配制100ml RPMI 1640母液：1、每4小组合称RPMI 1640干粉 1.04g，溶于100ml的3DW。2、置于搅拌器上搅拌40分钟，直到液体变为澄清为止。,3、通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。4、溶好以后置于超净台中进行0.22um滤过除菌，分装至试剂瓶中。5、瓶口封好，-20或4贮存。,（三）小牛血清的处理,新买的新生小牛血清一定要灭活；将新生小牛血清不开封置于56水浴锅中30min,期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。已灭活的血清贮存于4。,（四）生长培养基的配制,1双抗：（100000u/ml）160万单位青霉素/瓶+8ml 3DW = 20万单位/ml1g链霉素+5ml 3DW = 200000ug/ml各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22um过滤至1.5ml离心管，-20贮存。,2谷氨酰胺储备液（200mM）：,1.5g的谷氨酰胺溶于50ml3DW中（30mg/ml=200mM),0.22um过滤至1.5ml离心管中。-20贮存。注：200mM=200mmol/L（毫摩尔每升),3.饱和NaHCO3的配制,每组称取10g的NaHCO3溶于200ml 3DW 中，过滤除菌后分装于50ml试剂瓶。4保存,4. RPMI 1640生长培养基的配制,NaHCO3调pH至7.0,六、实验报告,写出各自配制试剂的步骤。叙述配制过程中所观察到的现象。,七、思考题：,血清在
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