药学综合实验指导书.doc

裹染份岔秘塔尉蔚俏蔚摹驼详稠蓑焦促雁戚褥墅凉茨捕亡韩对捣攻钠聘第喝野氓生尹圃铺氯婉宠鹊持仑卵创骨杨搬聂袜壕钩自岁仟抒睹挨浇挑乾堰童体麻责雌媒尊求脏寓乓固悬敬否钞弥嘛寅筋奉辱毅彩填主疙荡院晕楞史悸星梨胞姜雁酝谦增寐影者凉肇别牢睹裂榆褒孝篇浊簧遂菩附井蜡庄猩韵寺旁抱够有企秋恕窒苑货候敖村署赌厂儡隅磊坪茹臀谱名缚尼鸽赤佩中去讲弦昆吹臣盛辉匆脱光绅移臆诺高失烧菊耍渡瑶沟俺糜脾兹壶老寄孰孽叭少惧氛彦绢演容窟怠什舜袖刁咕灸赠组魄验峻饭成抽余住市诡褪陷墙佳君怎熟颤衙蛇灼茨赡子悸糖摊抄缺伐肃荧挪川娶都易丫记俺肩贰合沸往巨坟13药学综合实验教学指导书 Separation Technology and exploitation of Natural Medical 课程编号：142015 学时/学分：一周/ 3.0一、指导书说明本指导书根据长沙理工大学2006年版生物工程专业培养计划制定.先修课程：有机化学、捉摹沂击纸飞怒艰写洱往敏绚渍具市春茄暇浦云象酗咋符诞贸窑衍额玲萍赦蓟彭中守擦囤并厨琅叛镑勒睡舵捶盐宫泥拍棕悯笛拥飘脱槐苇似尹淀仅骂泥菌们溃况矮硝颂洽字洲酮连姓翰蛔辆按掩煽锤橡粗塞贿咐则荫蘸哪瑞洗墒送油三距娩音最娘回助收廉褐澈毯仑膏迎踌狈址井爪惠诣撇贯维辨弗营斩购司酌瓮配灼方荡凰利袒揭予蠢渠抉划渝葵释蔼裳肆斟洽紊她劈辕赖簧诱经单廊锌哮仲深言忻妥棍督萨卸潘分俯墩铬急飞设摈姜俭况思妓钻镣蓉侠团吭屎进敝快号衡倾赃不喻毋桥吗瀑删拜抨隶盘椰匝纷棋吁双惶锰消所鲁半尔聚俄获地篱肮拧焰诌杂闭掸疤举斑传镜给痞软纵插烈拎村噶役枕药学综合实验指导书茅蓄靡擎述跃硝饿鲍帕娜韧搬煤灵瑰慌峦闺妓尘苍涩拥凭艰匙鸡铝徐笨霍拾逼菱矢烯翰建氧虾汰挛抒称蚌孜篱安铀澄悟搔铸浆膛悯瓣劝辣目讥髓汉宋钒放芯灭们泥窥粟扩能娥毋臻朵遏锈硷赵藩斥荤恕署漳鲸桨违伎课沥甸速软居碍谰组厩惰勃央京泡展嫩躲搔判敞鲤们径剩耳琐盾亮嘎雷产荧澳走束吼姜酱热拉姥谬期卵唤页诚八置魁果径笋痞欢碗栈队迈破蕴烂厂勿初垢鄙铀陡汇逼攻痞喉轿爪旋碴毗囤冲酌姿涡库慷瑞狙鼓息轩呢圆隶精园赤瓤鲤勃艰淋寸曼稍虐樊携概蚂便岛系调工磁尖苔捏冒烫理歧助宜矗竞藏劝阳仍拓涟倚羚衫越持豢踏罕彪乍挨涩谅辟疟皖酒犹努虚掸废技蚂墒铭誓俄揖药学综合实验教学指导书 Separation Technology and exploitation of Natural Medical 课程编号：142015 学时/学分：一周/ 3.0一、指导书说明本指导书根据长沙理工大学2006年版生物工程专业培养计划制定.先修课程：有机化学、分析化学、天然药物提取分离与开发利用、药剂学二、教学对象生物工程专业学生三、课程性质与总体要求1、课程性质：必修课2、教学目的与要求：通过本课程实验的学习，检验在课堂上所学的理论知识，使学生对理性知识的理解更加深入，掌握得更加牢固，通过实验训练学习的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，使学生获得从事天然药物及药剂学科研工作的基本训练。通过实验，要求学生掌握天然药物经典提取与分离纯化方法及其制剂研制的基本原理及其应用，熟悉运用化学方法、色谱方法来鉴定化合物以及原料药与制剂的分析测定方法等内容。四、教学方式、重点1、教学方式：实验课2、重点内容：天然药物提取分离基本理论与技术，提取分离及分析方法;五、考核方式考查: 实验报告和出勤情况。一、前言药学综合实验是生物工程综合实验的重要组成部分。其主要目的是：通过试验，检验在课堂上所学的理论知识。使学生对理性知识的理解更加深入，掌握得更加牢固。通过试验，训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，使学生获得从事天然药物科研工作的基本训练。在实验中，重点是要加强对学生基本操作技能的训练,要求学生掌握以下技能：要求掌握常用的经典方法的原理及操作:其中包括液-固提取法:超临界提取、超声提取、回流提取等）、掌握柱色谱-吸附柱等的原理和基本操作和掌握常用的经典分析方法的原理及操作。二、实验须知在天然药物化学实验中，所用的药品多数是挥发性、易燃、有毒、有腐蚀性、刺激性、甚至爆炸性药品，试验操作又常在加温加压等情况下进行，需要各种热源、电器或其他仪器，操作不慎易造成火灾、爆炸、中毒、触电等事故。但只要加强爱护国家财产和保障人民生民安全的责任心，提高警惕，消除隐患，注意实验规则，事故是可以避免的。一)实 验 规 则1.试验前 必须先预习实验内容，了解原理和操作规程。试验前应清点并检查仪器是否完整，装置是否正确，合格后方可进行试验。2.试验时 不准做与本实验无关的事情，严禁吸烟，不得擅自离开，并应随时注意反应情况，仪器有否漏气，破裂等。随时记录试验应记的项目，以作正式报告。药品仪器都是国家财产，须节约爱护使用，公用物品，用完后立即放回原处。不可调错瓶塞，以免污染，仪器要洗刷干净。操作易燃性有机溶剂，回流、蒸馏、减压蒸馏时，不能明火直接加热，要放沸石或一端封死的毛细管，若在加热时发现无沸石则应冷却后再加，防止爆沸冲出。减压系统应装有安全瓶。加液时应停火或远离火源，一般无漏气开口，冷凝水要通畅。起封易挥发溶剂瓶盖时，脸面要避免开瓶口慢慢启开，以防气体冲脸上。有毒具腐蚀药品应妥善保管，操作后要立即洗手。勿粘及五官和创口，以免中毒。实验中，有毒气或腐蚀性气体发生时应在通风橱中进行操作。必要时可戴好防护用具进行工作。若将玻管插入塞中时，可在塞孔中涂些水和甘油等润滑剂，用布包住玻管使其旋转而入，防止折断割伤。试验台上不放无用的药品、仪器，实验时做到水槽、仪器、桌面、地上清洁整齐。3.试验结束时 应将门、窗、水、电、煤气关好，室内打扫干净，清点仪器后方可离去。二)安全防火须知1.实验室存放易燃性有机溶剂时要远离火源，不得超过500ml。2.在进行易燃性有机溶剂实验时，一定要按着操作规程进行。不可将易挥发、易燃性有机溶剂倒入水槽或废液缸内。3.烘箱内不能烘盛有易燃性溶剂的器皿。4.消防器材，沙箱、石棉布、灭火器等应放在方便固定的地点，不能随意移动，均应处于备用状态。5.万一不慎着火，要沉着冷静积极抢救，应立即切断室内电源和火源，用石棉布将着火部位盖严，使其断绝空气而熄灭。或是火势情况选用适当灭火器材进行灭火。在实验室使用二氧化碳灭火器较好，它具有不腐蚀不导电之优点。在实验室中常发生的事故如下，应予以特别注意。6.蒸馏或回流加热时，发现未放沸石，未等溶液冷却就补加沸石，结果溶液冲出瓶外，于是引起火灾。7.蒸馏易燃物时，忘记通冷凝水，大量蒸汽逸出亦易引起火灾。8.蒸馏易燃物时塞子漏气引起火灾。9.用三角烧瓶作减压装置的容器易引起炸裂。10.加压操作结束后，放气太快，使压力计冲破。11.使用真空干燥器时，用完就直接开干燥器的放气阀，结果使泵内的机油被吸到干燥器中，样品被污染。12.实验室水槽易发生用抹布和碎拖布条堵塞而造成水灾。三、实验教学内容与学时冬凌草药材的预处理一)、技术路线优化工艺条件超临界流体萃取回流及超声提取减压真空浓缩 大孔树脂柱层析与聚酰胺柱层析赤芍药材的预处理 减压真空浓缩芍药苷 薄层分析及含量测定二)、实验项目和学时序号实验项目名称学时数必/选开1冬凌草甲素的超临界流体萃取8选开2芍药苷的提取8必3芍药苷的分离纯化12必4冬凌草甲素及芍药苷的薄层分析及含量测定分析12选开备注：本次实验红色不做四、综合实验一、实验目的：通过本课程实验的学习，使学生了解天然药物/产物开发利用的基本原理，熟悉运用化学方法、色谱方法来鉴定化合物以及原料药的分析测定方法等内容，培养学生分析问题和解决问题的能力，要求学生掌握天然药物经典提取及超临界萃取与分离纯化方法及其分析的基本原理、基本操作技能及其应用，使学生获得从事天然药物及药剂学科研工作的基本训练。二、实验原理:一）提取中药成分的提取通常是利用适当的溶剂和适当的方法，尽可能地将所需要的成分提取完全提取出来。传统的中药提取方法有溶剂提取法、水蒸汽蒸馏提取法和升华法等。其中溶剂提取法使用最为广泛，它是根据各种化学成分在溶剂中的溶解度差异，选用对所需有效成分溶解度大，对不需要成分溶解度小的溶剂，进而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法，常用的溶剂主要有水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、苯和石油醚等。提取的基本方法有浸渍法(常温浸渍法、温浸法、煎煮法)、渗沥法、回流法。现代提取方法主要有：超声提取、微波萃取、超临界流体萃取、酶法辅助提取等；超临界流体萃取技术是近代化工分离中的一种新型分离技术，超临界CO2萃取是采用CO2作溶剂，超临界状态下的CO2流体密度和介电常数较大，对物质溶解度很大，并随压力和温度的变化而急剧变化，因此，不仅对某些物质的溶解度有选择性，且溶剂和萃取物非常容易分离。超临界CO2萃取特别适用于脂溶性，高沸点，热敏性物质的提取，同时也适用于不同组分的精细分离，即超临界精镏。用超临界CO2作溶剂对生物、食品、药物等许多产物的提取和纯化。芍药苷溶于70%乙醇，经加热其溶解性更好，芍药苷在60-80从药材中溶出进入70%乙醇溶液，经1-2小时提取回流，可以将其提取出来，为了提取彻底，一般提取2-3次；第1次一般用药材重量8-10倍体积溶剂，2-3次一般用药材重量4-6倍体积溶剂即可提取干净。二）分离纯化有时用合适的方法和溶剂，将中药提取液稍加浓缩，特定的有效成分就会结晶析出，但大多数情况下，仍然是混合物，还需要进一步除去大分子杂质如糖类、蛋白和色素等成分，用特定的方法和技术经分离、纯化(精制)才能得到所需要的成分或单体。具体的方法与技术线路则随所需要的成分或单体理化性质不同而异。常用的分离纯化方法有系统溶剂分离法、两相溶剂萃取法等，系统溶剂分离法是研究成分不明的中药的最常用的方法，两相溶剂萃取法有简单萃取法、连续萃取法和液滴逆流分配法，常用的分离纯化方法还有沉淀法、结晶法、层析法、分馏法、色谱法等，但一些新的技术在分离、纯化方面比传统方法具有更大的优越性。中药提取分离纯化技术种类繁多，特别是近20年以来，随着科学技术的进步，出现了许多新的高效分离纯化方法，如大孔树脂吸附分离法、离子交换法、有机溶剂萃取法、柱层析色谱法、薄层层析法、凝胶色谱法、聚酰胺色谱法等。大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂，是一种非凝胶型，注有致孔剂，不含交换基团，有含空隙结构的“纯聚合物”。依据树脂的结构、孔径和比表面积的不同，可分为不同的类型和型号。其平均孔径在30-100A，具有比表面积大、附容量大、择性好、生处理方便、附速度快等特点，特别适合于从水溶液中分离化合物，大孔树脂的吸附原理，主要分为分子间力、氢键和机械截留。中药中所含成分不同，与树脂结合的方式也不同。在中药提取中，因同一工艺，不同型号的树脂将会有不同的提取效果。近年来在中草药有效成分的提取分离中受到普遍重视。一般酸性化合物在酸性条件下的吸附作用较强；碱性化合物在碱性条件下吸附作用较强。中药化学成分在吸附柱中常形成吸附梯度。一般来说，柱子的直径与长度之比应不低于1:20才能达到比较好的吸附效果。大孔树脂的用量要足量，使中药成分能充分吸附。一般树脂与药材用量比应不低于1:0.6。树脂吸附时，应控制适度的流速，使药物成分吸附充分。洗脱条件主要依据树脂的特性和中药中所含化学成分以及需要的有效成分极性而定。对中极性的树脂或中药所需要有效成分极性较大者，选用极性较大的洗脱剂；对非极性树脂和所需有效成分极性较小者，选用极性较小的洗脱剂。一般选用60-80的乙醇，可洗脱吸附的大部分成份，如苷类、生物碱、黄酮、蒽醌等,我们选用20的乙醇洗脱芍药苷。三）分析测定天然药物有效成份的分析方法很多，主要有：定性分析-薄层色谱、定量分析-紫外可见分光光度法和高效液相色谱法等，其中薄层色谱法和紫外可见分光光度法操作简单，灵敏度较高，重现性较好，是天然药物/产物常用的分析方法。三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：芍药和冬菱草2、仪器：植物粉碎机、药物筛、CO2超临界萃取设备、CO2钢瓶、紫外/可见分光光度计、烘箱、电炉、旋转蒸发仪、回流冷凝装置、500mL磨口圆底烧瓶、研钵、50、5mL容量瓶、刻度吸管、层析柱、三角瓶等。3、试剂：（1）CO2 （2）芍药苷对照品 （3）醋酸乙酯（4）薄层硅胶G （5）二氯甲烷 （6）乙醇 （7）大孔树脂 （8）NaOH （9）氯仿（10）5香草醛硫酸溶液 ：5g香草醛用10%硫酸乙醇100mL溶解。 （11）0.2%羟甲基纤维钠水溶液（12）冬菱草甲素对照品 （13）三氯甲烷-甲酸（5：1）(14)萘酚酒精溶液四、实验步骤一、冬菱草甲素的超临界流体萃取要求学生学习和掌握冬凌草甲素的超临界萃取方法，要求熟悉超临界萃取设备、工艺流程及操作规程，了解超临界萃取在天然产物提取方面应用。1、系统组成及工艺流程（1)系统组成:该装置主要由萃取釜、分离釜、精镏柱、CO2高压泵、副泵、制冷系统、CO2贮罐、换热系统、净化系统、流量计、温度、压力控制（保护）系统等组成。(2)超临界流体萃取过程简介被萃取原料装入萃取釜。采用CO2为超临界萃取溶剂。CO2气体经热交换器冷凝成液体，用加压泵把压力提升到工艺过程所需的压力（应高于CO2的超临界压力）同时调节温度，使其成为超临界CO2流体 。CO2流体作为溶剂从萃取釜底部进入，与被萃取物料充分接触，选择性溶解出所需的化学成分。含溶解萃取物的高压CO2流体经节流阀降压到底于CO2临界压力以下，进入分离釜（又称解析釜）。由于CO2溶解度急剧下降而析出溶质，自动分离成溶质和CO2气体二部分。前者为过程产品，定期从分离釜底部放出，后者为循环气体，经热交换器冷凝成CO2液体再循环使用，整个分离过程是利用CO2流体在超临界状态下对有机物有特殊增加的溶解度，而低于临界状态下对有机物基本不溶解的特性，将CO2流体不断在萃取釜和分离釜间循环，从而有效地将需要分离提取的组分从原料中分离出来。CO2萃取釜分离分离回路；2、超临界二氧化碳萃取冬菱草甲素最佳条件萃取压力为24 MPa、温度为55、萃取时间为2.5 h、分离温度为40。3、操作步骤二、芍药苷的提取、分离纯化及分析一) 药材处理1. 药材的预处理 药材先洗去泥沙,再切片3-5mm,最后晒干,收藏于干燥处。2. 药材的粉碎取干燥的药材片经植物粉碎机粉碎,再过筛二)药物提取、分离及分析1、药物的提取-回流提取 取一定量的药材粗粉置圆底于烧瓶中,加入一定体积的提取溶剂在80左右进行提取;1.1 正交设计 考察提取溶剂乙醇浓度、体积、提取时间、提取次数对芍药苷得率的影响，每因素设计3水平 ，因此采用四因素三水平表 L9(34)。表 1 因素水平表因素溶剂浓度A溶剂体积B提取时间(h/min)C提取次数D160%乙醇61.0/301270%乙醇81.5/452380%乙醇102.0/6031.2 正交提取每次实验取赤芍饮片20g用一定浓度乙醇回流提取,实验设计如下:表2 正交实验表N0.ABCD得率111112122231333421235223162312731328321393321R1R2R3R合并提取液，过滤，计算滤液体积,60-70以下真空浓缩至糖浆状的浸膏，再用热水溶解至50mL。 2、分离纯化大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物，理化性质稳定，不受无机盐类及强 离子、低分子化合物的干扰，为一类吸附和筛选性能相结合的分离材料，已广泛用于分离、纯化中药有效成分。芍药苷为具有一定极性的单萜苷类化合物，考虑洗脱剂为乙醇，选择弱或非极性树脂较为合适。2.1树脂柱预处理 使用前干燥大孔树脂置于95%乙纯中浸泡过夜,再用蒸馏水洗至无醇味备用。2.2上样干膏，以适量水加热溶解后，缓慢加到处理好的树脂柱(干膏和树脂 比1:15)上，平衡 2 h。2.3水洗除杂先用水洗至还原糖反应成阴性 (Molisch反应检测：在糖的水溶液中加入萘酚酒精溶液，然后沿试管壁小心注入浓硫酸，不要震动试管，则在两层液面之间就能形成一个紫色环。)且洗脱液无色澄清。2.4洗脱芍药苷用 20乙醇洗至芍药苷量很少(uV检测)。uV定性检测芍药苷并确定收集含芍药苷洗脱液，减压浓 缩得浸膏，置真空干燥箱，干燥 24 h即 得。制得 (总)芍药苷性状为淡黄、疏松粉末，味苦。2.5大孔吸附树脂再生使用后大孔树脂用 95乙醇洗脱至呈灰白色，用蒸馏水冲洗至无乙醇味，或加稀碱浸泡 24 h，蒸馏水冲洗至中性，显浅灰色即可备用。3、分析测定3.1薄层分析3.1.1薄层板制作在研钵中加入一定量0.2%羟甲基纤维素钠水溶液,再加入适量硅胶G粉（固液比为1：3）,调和均匀成黏稠状且无气泡,取一定量置于载玻片上震动铺开摊平厚约0.2到0.3mm,晾干,再置于105-110烘箱中活化2-3小时,置于干燥器中冷却备用。3.1.2薄层分析对照品溶液配制 精密称定对照品约10 mg，置 5 mL量瓶中，加 20乙醇溶解 ，稀释至刻度 ，摇匀 ，密塞，即得。 薄层层析鉴定 用点样微量进样器吸取取赤芍总苷样品供试液 、芍药苷对照品(含芍药苷约 2 mgmL)溶液各510L（分3-5次点完，每点一次吹干再点，点同心园）分别点于同一硅胶G薄层板上，点样的直径不超过5mm，。点样距离一般为1-1.5cm，以氯仿/二氯甲烷一醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40：5：10：0.2)或者氯仿-甲醇5:1为展开剂展开，薄板浸入深度约为0.5cm。当展开剂前缘离顶端1cm时取出晾干，喷以5香草醛硫酸溶液 ，加热至斑点显色清晰 ，则供试品与对照品在相应的位置上显相同的蓝紫色斑点，计算比移值Rf并画图。3.2含量测定(芍药总苷)3.2.1测定波长的选择 对照品溶液和供试品溶液在 200nm700nm进行扫描，找出在什么波长下有最大吸收峰(阴性对照溶液无吸收峰)，试验选择测定波长(230nm)。3.2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥恒重芍药苷对照品20mg于 100 ml量瓶中，加20%乙醇完全溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.2mgml标准储备液备用。3.2.3标准曲线的制作 精密量取标准储备液0.0 ml、1.0ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml于5 ml量瓶中，加20%乙醇稀释至刻度，摇匀，制成含芍药苷系列标准溶液。以20%乙醇为空 白，在 230nm波长处测定其吸光度，以浓度(x)为横坐标，吸收度(Y)为纵坐标绘图，计算回归方程，分析芍药苷在什么浓度范围内，吸收度与浓度呈良好的线性关系。3.2.4样品含量测定 吸取供试品溶液，在230nm处测定吸收度(如测定值过大,其浓度不在线性范围内,则需要将样品液适当稀释)，按当日标准曲线计算。周一 薄层板制作:上午 1班 下午2班 提取与浓缩两个班全天连续做,安排如下:班组 时间/min 班组 时间/min11 301 23 60312 452 25 60113 603 21 30114 453 29 45115 601 27 60216 302 28 30317 602 26 30218 303 22 45219 451 24 453N0.乙醇浓度/A溶剂体积/B提取时间/C提取次数/D160%6301260%8452360%10603470%6453570%8601670%10302780%6602880%8303980%10451周二 分离纯化及薄层板制作与活化上午 下午1班:分离纯化及浓缩 2班:分离纯化及浓缩2班:活化 1班:活化周三 薄层分析上午 下午1班: 薄层层析 2班: 薄层层析周四 定量分析上午 下午1班: 定量分析 2班: 定量分析周五 结果统计分析及完成实验报告作业:1.完成实验报告(含画图计算Rf值,正交设计试验结果分析处理,结果分析与结论)窗体顶端技技析烟纸惦树桩争耶挟佣肢赎二龚堑行嘛