抗菌药物敏感试验

第四章 抗菌药物的敏感性试验药敏试验的意义1、可预测抗菌治疗的效果2、指导临床抗菌药物的使用3、发现或提示细菌耐药机制，帮助临床医生合理使用抗菌药物4、监测细菌的耐用性，分析耐药菌的变化，预防和控制耐药菌感染的发生和流行,抗菌药物的敏感性试验,常用方法：,纸片扩散法微量液体稀释法E-TEST法,原理： 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。,纸片扩散法（Kirby-Bauer法）,操作方法 ：1.将在约56恒温的无菌M-H（水解硌蛋白）琼脂倾注直径为90mm的平板，其厚度 4mm。,2.无菌挑取孵育1624h的血平板上45个菌落。,3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarland No 0.5管。,4.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。,5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置310分钟 后贴上标准抗生素纸片。,6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培 南、氨曲南、庆大霉素；铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南；葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；,肠球菌属：青霉素 、万古霉素 、甲氧苄啶/磺胺异 噁唑 、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、氨苄西林不动杆菌属：头孢他啶 、亚胺培南、阿米卡星、哌拉 西林/他唑巴坦、头孢吡肟 、头孢曲松 、环丙沙 星、米诺环素；洋葱伯克霍德菌：头孢他啶 、米诺环素、甲氧苄啶/磺 胺异噁唑 、美罗培南 ；,嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙 星、米诺环素 ；嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、头孢 他啶、美罗培南、阿奇霉素、环丙沙星、头孢克洛；淋病奈瑟菌：头孢曲松、环丙沙星、青霉素、大观霉素、 四环素 ；肺炎链球菌：红霉素 、苯唑西林 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、克林霉素、左氧氟沙星、四环素、万古霉素 ； 除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。,7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂 的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。,8.经过351624h孵育。,9.取抑菌环直径，根据 CLSI（clinical and laboratory standards institute ）标准，报 告细菌对该抗生素 敏感(susceptible,S)、 耐药(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。,原理： 聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时加入100l浓度为105 CFU/ml的菌液，盖上盖板，351620h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，通过CLSI标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼脂平板作次代培养，经35过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死99.9原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)。,微量液体稀释法 (microdilution test),操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解,2.抗菌药物母液的稀释,3.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素 100l，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。,4.挑选1824小时的菌落置M-H肉汤增菌46小时。,5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。,6.用微量加样器接种100l 到96孔中，盖上盖板。 同时作阳性、阴性对照。,7.手工看浊度或仪器自动 判读。按照CLSI标准报 告细菌对某抗菌药物为 敏感、耐药和中介。,原理： E试条是一条5mm50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度，对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。,E-TEST,1.挑取1620h的菌落2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。,操作方法：,3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表面（每次转60）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。,4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 6条，90mm平板只能放置12试条 。5.孵育，置平板于35孵育1624h。,6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交 处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。,第九节 细菌的分类命名,一、分类原则:细菌的分类原则上分为传统分类和种系分类。,分类方法：（1）人为分类法： 以细菌形态和生理生化特征为依据，分为： 传统分类法 和 数值分类法（2）系统分类法：以细菌大分子物质（核酸、蛋白质）结构的同源程度进行分类，称为种系分类或自然分类,具体到细菌鉴定和分类的方法包括表型分类：以细菌的形态和生理特征为依据的分类方法，即选择一些较为稳定的生物学性状，如菌体形态与结构、染色性、培养特性、生化反应、抗原性等作为分类的标记，它奠定了传统分类的基础。,分析分类：应用电泳、色谱、质谱等方法，对菌体组分、代谢产物组成与图谱等特征进行分析，为揭示细菌表型差异提供了有力的手段。,基因型分类：分析细菌的遗传物质，揭示了细菌进化的信息，是最精确的分类方法。包括DNA碱基组成（G+C mol%）、核酸分子杂交（DNA-DNA同源性、DNA-rRNA同源性）和16S rRNA同源性进行分析。其中16S rRNA更为重要，因其在进化过程中保守、稳定，很少发生变异，是种系分类的重要依据。,国际上最具权威性的细菌分类系统专著伯杰氏系统细菌学手册（1984）和伯杰氏鉴定细菌学手册（第9版，1994）都已反映了细菌种系分类的研究进展。最新出版的伯杰氏系统细菌学手册（第2版，2004）已收集了4000余种模式菌株的16S rRNA序列，将原核生物分为两个域，即古生菌域和细菌域，前者分为2个门，后者分为24个门，依次再分为纲、目、科、属、种。,细菌与生物分类相同: 介、门、纲、属、种、型,分类：属（genus）, 种（species） 型（type）， 株（strain）,二、种、型、株的概念,种（species）：生物学性状相似的群体 组成，是细菌分类的最基本单位,型（type）：同一种细菌也存在有差异 差异小者称型; 差异大者称亚种或变种,株（strain）：不同来源的同一种细菌称株,标准株（standard strain ）：通过生化反应和血清学鉴