克隆文库的构建及其在微生物分子生态学中的应用

,克隆文库的构建及其在微生物分子生态学中的应用,1.克隆文库的构建,2.克隆文库的筛选和鉴定,3.克隆文库在微生物分子生态学 中的应用,4.参考文献,1. 克隆文库的构建,1.1 基因组文库1.2 cDNA文库1.3 16SrDNA、18SrDNA文库,1.1基因组文库,1.1.1 what?基因组文库：完整的基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。1.1.2 how？构建文库时先将基因组DNA通过机械剪切或酶切，使之成为一定大小的片段，随机与适当的载体重组、克隆。1.1.3 why？ A：分离有用的目的基因 B：保存某种生物的全部基因,理论文库克隆子数 =,基因组DNA总长,片段平均长度,N基因组文库克隆总数 P所需机率f插入片段与基因组DNA长度之比,1.1.4基因组文库规模,实际克隆数：,理论克隆数,1.1.5基因组文库的构建步骤,A：DNA片段的制备B:DNA片段与载体连接C:载体的选择D:重组DNA的转化和克隆E:筛选鉴定基因组,A：DNA片段的制备,从生物组织中分离出纯化的基因组DNA，用限制酶进行部分降解或完全降解，得到各种长度的DNA片段。,B: DNA片段与载体连接,用限制性内切酶切割载体DNA，使载体形成与外源DNA相匹配的黏性末端。再用DNA连接酶将DNA片段与载体连接起来，成为重组DNA。,C: 载体的选择,质粒载体可承载15kbDNA左右片段 (有效的范围为10kb)载体可承载25kbDNA左右片段(有效的范围为20kb)Cosmid载体可承载45kbDNA左右片段(有效的范围为10Mbp,One more thing,D: 重组DNA的转化和克隆,将重组DNA导入受体菌中，进行体外包装噬菌体进行侵染，或者转化时质粒DNA进入细胞。,E: 筛选鉴定基因组,由于基因组文库包含了DNA分子的所有随机片段形成的重组DNA克隆，因此利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到携带所需要的目的基因片段的重组克隆体。,1.2 cDNA文库,1.2.1 what?cDNA文库就是以生物细胞的mRNA为模板经反转录变成双链DNA(cDNA)，然后将这些cDNA装入载体，而构建成的一个含有各种cDNA克隆的克隆群。 1.2.2 why？由于基因组DNA中编码基因只占了一部分（尤其是真核生物），因此可以通过mRNA反转录的方式得到编码基因。cDNA文库是获得具有编码序列蛋白质基因的常用手段。,1.2.3 how？,A：高质量mRNA的制备B:反转录生成cDNAC:cDNA与载体连接D:重组DNA的转化和克隆E:筛选鉴定cDNA,A：高质量mRNA的制备,真核生物mRNA仅占总RNA含量的1%-5%。利用亲和层析法分离出mRNA，再对mRNA按大小分级，使mRNA具有适当的长度。接下来对mRNA的翻译活性进行检验。,B:反转录生成cDNA,以有翻译活性的mRNA为模板在反转录酶的作用下进行反转录，形成RNA-DNA杂交分子。用核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA降解，使之变成单链DNA。以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。,C: cDNA与载体连接,将cDNA的两端加上人工化学方法合成的人工接头，它是其序列中含有限制酶识别位点的寡核苷酸片段。用连接酶把接头和双链cDNA相互连接，再用限制酶切割，使原来的平末端的cDNA变成黏性末端，插入到已用限制酶处理的载体中，并用DNA连接酶连接起来。,D:重组DNA的转化和克隆,将cDNA与载体连接成的重组DNA导入到受体菌菌群中储存，每个受体菌都含有一段不同的cDNA。如果用到的载体为噬菌体时，含有cDNA的重组噬菌体还需要经过体外蛋白质外壳包装反应，才能成为具有侵染和复制能力的成熟噬菌体。,E:筛选鉴定cDNA,当获得了含重组DNA的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到携带所需要的目的基因片段的重组克隆体。,1.3 16SrDNA、18SrDNA文库,2.克隆文库的筛选和鉴定,2.1抗生素抗性，挑选出含有质粒的克隆。2.2蓝白斑筛选，挑出带有插入片段的克隆。2.3核酸杂交2.4特异性免疫学检测,设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacZ的基因，lacZ中包括：一段-半乳糖苷酶的启动子；编码 肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的-半乳糖苷酶，但当菌体,蓝白斑筛选,中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用，在诱导剂IPTG的作用下可以使X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即-互补。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS（即靶基因），使肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无互补作用，不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。,最常用、最可靠的方法之一。可大规模地分析文库的克隆子。核酸杂交的主要步骤是核酸分子的变性和选择性退火。双链DNA或处于二级结构的RNA分子被变性回复到它们原来单链、线性的形式，从而使它们处于能与互补的核苷酸链退火杂交的状态。双链DNA采用碱(如NaOH)或高温处理变性，RNA分子则通常是在甲酰胺存在的情况下通过加热使之变性。互补的核苷酸链通常是外部加入的与母板RNA序列互补的DNA链与母板DNA互补的DNA或RNA链。外部加入的互补链若事先被标记，则可以作为探针从核酸混合物中检测到与之杂交的特定的目标核酸序列。而且由于氢键的微弱性，互补的单链核苷酸分子经退火而形成核酸双链分子的过程是可逆的。,核酸杂交,特异性免疫学检测,在cDNA表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测。,3.克隆文库在微生物分子生态学中的应用,3.1 微生物分子生态学的概念3.2 克隆文库在分子生态学中的应用,3.1 微生物分子生态学的概念,微生物分子生态学是研究生态环境中微生物与其周围生物以及微生物与环境之间相互关系的学科。它主要以微生物基因组DNA的序列信息为依据，通过分析样品中DNA分子的种类和数量来反映微生物区系的组成和群落结构及其变化，进而研究微生物与生物环境、微生物与非生物环境之间的相互关系及其分子机制。,3.2 克隆文库在分子生态学中的应用,3.2.1 标记核酸探针杂交技术应用3.2.2 16SrRNA/rDNA、18SrRNA/rDNA序列分析技术,3.2.1 标记核酸探针杂交技术应用,原位荧光杂交技术(FISH)是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，应用于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测，是目前在微生物分子生态学领域应用比较广泛的方法之一,3.2.2 16SrRNA/rDNA、18SrRNA/rDNA序列分析技术,A:16SrDNA序列B:细菌分类与鉴定中的应用实例,A:16SrDNA序列,核糖体16SrDNA基因序列全长约1550bp，是由交替的保守区和可变区组成，利用保守区域能设计引物，此引物几乎能与所有种属的核糖靶位点结合。16SrDNA分子内的变异程度也许并不能区分亲缘关系十分接近的细菌，但DNA的多样性区域可提供序列的多态性信息，基因序列足够长，完全能够提供足够的信息鉴定病原微生物。通常靶序列在300-900bp之间就可以适用于多数广谱PCR的诊断。引物通常选择在具有互补的保守区域，如序列开始端、中间端(540bp)、序列末端(约1550bp)，在各段引物之间的可变区可以用于细菌分类鉴定。,B:细菌分类与鉴定中的应用实例,a：研究人员可以通过对未知细菌进行16SrDNA测序和比较分析,即可达到细菌分类与鉴定的目的。通常将某一未知细菌的16SrDNA序列与GenBank中的已提交的16SrDNA序列进行同源性比较,便可初步确定该细菌的种属地位,某些细菌甚至可以鉴定到种的水平。b：应用16SrRNA基因文库技术分析土壤细菌群落的多样性。c：构建16SrDNA克隆文库的方法对好氧颗粒污泥中细菌的组成进行分析, 以期为进一步提高好氧颗粒污泥的处理能力和稳定性提供理论指导。,4.参考文献,1李玉英，梁子安,秦本玲. 微生物分子生态学研究方法进展J. 南阳师范学院学报 第3卷第6期 2004年6月。2王德枝. 基因文库的构建与使用J. 生物学教学2010年（第35卷）第12期.3刘星,仇雪梅,高祥刚,赫崇波. 基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用J. 现代农业科技 2008年第16期.4白蓝,赵明文,贾军伟,李鹏,王金斌,潘爱虎. 16SrDNA克隆文库法探索转基因香石竹对土壤细菌群落的影响R. 微生物学通报APR 20,2012,39(4):435-447.5肖升木. 分子生态学技术在环境微生物群落与功能基因中的应用研究D. 东华大学. 2010.6黄立南,聂湘平,蓝崇钰.核酸杂交技术在微生物生态学上的应用J. 中山大学环境科学系,中山大学生命科学学院. Ecologic Science 第20卷 第1,2期2001年. 7黄钦耿. 森林红壤微生物的功能生态学分析及宏基因组文库构建D. 福建师范大学. 2011.8樊奔. 土壤宏基因组文库构建与土壤微生物群落结构指示方法的初步建立D. 南京农业大学. 2003.9吕昌勇,陈朝银,葛锋,刘迪秋,孔祥君. 微生物分子生态学研究方法的新进展J. 中国生物工程杂志 China Biotechnology,2012,32(8):111-118.,10李国媛,李俊,姜昕,李力,沈德龙. 应用16S rDNA克隆文库法分析有机物料腐熟菌剂细菌组成J. 微生物学通报 2007年05期.11王霞,陈哲,袁红朝,等. 应用16S rDNA克隆文库技术研究长期稻草还田对水稻土细菌多样性的影响J. 生态学报2010,30(13):3865)3874.12刘玮琦,茆振川,杨宇红,谢丙炎. 应用 16S rRNA 基因文库技术分析土壤细菌群落的多样性R. 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 48(10):13441350;4 October 2008.13李建婷,纪树兰,刘志培,秦振平,刘缨,杨媛媛. 16S rDNA克隆文库方法分析好氧颗粒污泥细菌组成J. 环境科学研究 第22卷第10期 2009年10月.14周玉亭,曹建斌. -互补与蓝白斑筛选机制的探究R. Biotechnology Bulletin 2010年第8期.15田风贵,马志杰,陈智华. 分子生态学与生物多样性研究J. Journal of Southwest University for Nationalities (Natural Science Edition) 2005年01期.16李武,赵勇,王玉炯. 元基因组文库分析技术研究进展J. Acta Ecologica Sinica,2007年05期