《兽药残留分析》PPT课件.ppt

第九章兽药残留分析 抗生素类兽药 一 兽药定义及兽药残留来源 一 兽药定义1 兽药是指用于预防 治疗 诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能的物质 含药物饲料添加剂 主要包括 血清制品 疫苗 诊断制品 中药材 中成药 化学药品 抗生素 生化药品 放射性药品 外用杀虫剂 消毒剂等 在我国 鱼药 蜂药 蚕药也列入兽药管理 2 兽药残留对食品动物用药后 动物产品的任何食用部分中的原型药物或 和其代谢产物 包括与兽药有关的杂质的残留 二 兽药残留来源现代养殖业日益趋向于规模化 集约化 不可避免地带来了大量的疫病问题 为了提高饲料报酬和满足人们对动物性食品的需要 需要大量使用饲料药物添加剂 这已成为保障我国畜牧业发展不可少的一环 目前 造成我国兽药残留的原因 大致有如下 1 非法使用违禁药物滥用己烯雌酚给鸡催肥 盐酸克仑特罗 又叫瘦肉精 在饲料中添加避孕药 雌性激素养黄鳝 甲鱼 2 不遵守休药期规定兽药用于防病或治病是有疗程规定的 有病的动物也不可能无休止地吃药 特别是药物饲料添加剂 都规定了休药期 如抗菌促生长的喹乙醇预混剂 体药期是35天 3 超剂量 超范围 对象 用药4 不遵守有关标签的规定 二 兽药残留的危害 1 对人体产生直接毒性作用1 急 慢性毒性2 激素样作用3 过敏反应2 对人类胃肠道微生物平衡产生破坏3 增强人类病原菌的耐药性4 环境危害 三 常见兽药的种类 1 抗生素类药物2 磺胺类药物3 硝基呋喃类药物4 抗寄生虫类药物5 激素类药物 分析方法主要有微生物分析法 放射化学法 免疫法 包括放射免疫法 酶联免疫法 荧光免疫法 化学发光免疫法 气相色谱法 薄层色谱法 高效液相色谱法 包括柱前和柱后衍生荧光法 液相色谱 质谱法和气相色谱 质谱法 四 抗生素类兽药 抗生素是由细菌 真菌或其他微生物在生活过程中所产生的物质 具有抑制或杀灭细菌 真菌 螺旋体 支原体 依原体等致病微生物的作用 抗生素是能抵抗致病微生物的药物 是抗菌消炎药中最大的一类 抗生素类药物广泛地应用于各种感染性疾病 其品种繁多 市场上有售的常用的品种 1 四环素类2 大环内酯类3 内酰胺类4 氨基糖甙类5 氯霉素类 第一节四环素类 一 四环素类化合物的结构和性质四环素类抗生素 TCs 具有共同的基本母核 氢化并四苯环 仅取代基有所不同 常见的四环素类药物包括 四环素 TC 土霉素 OTC 金霉素 CTC 强力霉素 DC 二甲胺四环素 MINO 甲烯土霉素 MTC 去甲基金霉素 DMCTC 和毗甲四环素 PRMTC 等 金霉素 土霉素和去甲基金霉素是3种由微生物自然产生的四环素类药物 已经被成功地从真菌中分离出来 其他四环素类药物如强力霉素 甲烯土霉素 二甲胺四环素 毗甲四环素及四环素则是通过半合成法制备的 二 四环素类抗生素的毒性及其代谢四环素类药物为广谱抗生素 是相互关系密切的抑菌性抗生素 抗菌谱和毒性相似 对多种 溶血性链球菌 非溶血性链球菌 革兰阴性杆菌 立克次体 螺旋体 支原体属和衣原体属均有效 四环素类抗生素在动物养殖中应用广泛 主要作为饲料添加剂用于预防和治疗疾病 近些年来 在牛 猪 绵羊 山羊 家禽及水产养殖中常用的四环素类抗生素主要是土霉素 金霉素 四环素和强力霉素等 一 四环素类抗生素的代谢四环素类药物的给药可通过几种方式 口服 添加到饲料或饮用水中 注射及通过乳腺注入 无论采用何种给药方式 四环素类抗生素都能在体内广泛分布 而在肾脏和肝脏组织中含量尤高 由于四环素类药物普遍为低亲脂性 因此在脂肪中检测不到四环素类药物残留 相反 由于四环素类抗生素对钙具有亲和性 能在家禽 猪 牛以及鱼类的骨骼组织中蓄积 二 四环素类抗生素的毒性与最大残留限量四环素类抗生素口服吸收良好 分布广泛 易在骨骼和牙齿中沉积 可在肝脏中富集 造成肝损害 三 四环素类兽药残留样品前处理 一 样品提取由于四环素类抗生素的强极性性质 在生物样品中易与蛋白质形成共轭物而提取困难 稀无机酸可将四环素类化合物与蛋白质分离 但四环素类化合物一旦进入水相 由于其在有机相的分配系数较低 再将其提取入易挥发的有机相进行浓缩和净化就变得困难了 多数四环素类化合物对光敏感 而且在强酸或碱性条件下不稳定 在弱酸性 pH 3 条件下形成差向异构体 在强酸性 pH 2 条件下形成脱水产物 分析液体样品 如牛奶 中的四环素类抗生素残留时 一般需要一个预离心步骤以除去脂肪 在净化步骤之前 还需采用乙酸盐缓冲液 磷酸盐缓冲液对样品进行稀释 对于半固体样品 如肌肉 肾脏 肝脏 通常需要更强烈的样品预处理步骤以破碎组织 可采用切碎机和组织均质器通过机械分散作用来完成这一步骤 将四环素类抗生素从可食动物产品中分离出来是一个相当复杂的步骤 主要困难在于这些化合物在被分离时倾向于与金属离子形成鳌合物或与样品基质成分键合 为提高提取效率 推荐采用EDTA 柠檬酸盐 琥珀酸盐或草酸等四环素类化合物的竞争性鳌合剂 同时需要考虑采取适当的提取条件以减少与蛋白质的键合 强酸或酸性脱蛋白剂非常适合用来降低四环素类化合物与蛋白质的键合作用 但在强酸性条件下四环素类抗生素易降解为脱水产物 pH4 0的琥珀酸盐缓冲液 酸性乙睛和酸性甲醇都被成功应用于四环素类抗生素的提取 二 样品净化在样品提取步骤获得的水相或有机相样品提取液中待测四环素类抗生素的浓度可能非常低 而且还可能含有共提取物 如果样品的最终溶液中含有共提取物 会增加检测器的背景噪声 难以检测痕量浓度水平的待测物质 为减少干扰和浓缩待测化合物 初始样品提取液需要采用进一步的净化步骤 如液一液分配 固相萃取 超滤 免疫亲和色谱或在线微量富集技术 1 固相萃取SPE由于不需要大容量的溶剂 样品基质中的四环素类抗生素 又省时省力 固相萃取被广泛用于分离和净化生物样品中的四环素类抗生素 TCs具有苯环 多种活性官能团 因此各种如的SPE都能用于TCs的净化 SPE主要包括C18柱 阳离子交换柱 苯基SPE柱等 应用于分部环素类抗生素的固相萃取剂主要为反相C18吸附剂 由于四环素类抗生素易于和金属离子鳌合 为避免待测物在过固相萃取柱时的潜在损失 一般先采用EDTA对反相固相萃取柱进行预处理 2 液 液分配可通过将待测化合物从水相转移到不互溶的有机相而直接去除基质成分 存在问题 四环素类化合物由于极性太强 在任何pH值都不能被定量转移入不互溶的有机相 当采用四丁基铵盐作为离子对试剂时 在pH8 2条件下采用二氯甲烷提取土霉素和四环素的回收率超过85 三 四环素类兽药的分析四环素类抗生素残留的测定方法主要包括微生物抑制法 酶联免疫法 分光光度法 薄层色谱法 高效液相色谱法 液相色谱一质谱法等 样品经过提取和净化后 四环素类抗生素可通过薄层色谱或液相色谱进行分离 再采用分光光度 荧光或质谱检测系统进行定量浦定 1 微生物抑制法微生物法是一种传统的测定四环素类化合物和其他抗生素的分析方法 测定原理 是根据抗生素对其敏感的特定微生物的生长抑制作用 通过抑菌圈的大小来进行样品中抗微生物药物残留的判断 测定抑菌圈直径 样品抑菌圈直径小于阳性对照抑菌圈直径判定为阴性 否则判定为阳性 蜡状芽抱杆菌ATCC11778是一种经典的用于分析四环素类的微生物 其对金霉素的灵敏度为0 005mg L 对四环素和土霉素的灵敏度为0 025mg L 对二甲胺四环素的灵敏度为0 001 0 002mg L 相对于其他分析方法 微生物抑制法操作简便 价格低廉 不需要精密仪器和复杂的样品前处理过程 因而适合大量样品的筛选 微生物抑制法的最大缺点是不能区分具体的四环素种类 因此也难以进行定量检测 2 酶联免疫法间接酶联免疫法可用来检测牛奶中的四环素类抗生素 四环素 牛血清白蛋白共轭物用于抗体制备 同源的四环素 酪蛋白共轭物作为包埋试剂 而羊抗兔IgG 辣根过氧化物酶作为第二抗体 牛奶样品经离心脱脂 采用磷酸盐缓冲液至少以1 30的比例进行稀释后 直接采用酶联免疫法进行测定 检测限可达5ug kg 当采用商业化试剂盒检测蜂蜜中的四环素 金霉素和土霉素残留时发现其对金霉素具有强烈的交叉反应活性 试剂盒对四环素和金霉素的检测限均为15ug kg 但由于所用抗体与土霉素的交叉反应活性较低 对土霉素的检测限为250ug kg 实验表明 空白蜂蜜样品经缓冲液稀释50倍已足以消除基质干扰 3 薄层色谱法薄层色谱法 TLC 又分为正相薄层色谱 NP TLC 和反相薄层色谱 RP TLC 正相薄层色谱一般使用纤维素 硅胶 硅藻土等作为吸附层 总体而言 正相薄层色谱是一种简单的 不需特殊设备的分离方法 但在制板时却要花费大量时间消除TCs与金属离子的鳌合作用 故通常在吸附剂和溶剂系统中加入EDTA以消除金属离子的影响 反相薄层色谱分析TCs时 溶剂系统中通常加入草酸以消除金属离子的影响 在RP TLC溶剂体系中通常含有磷酸 柠檬酸 酒石酸 EDTA等以获得对TCs好的分离效果 但脱尾现象比较严重 在RP TLC溶剂体系中加人草酸后 可以消除TCs与金属离子的鳌合作用 减少脱尾现象 4 高效液相色谱法反向LC操作简单 方法灵活 已成为包括四环素类抗生素在内的许多药物残留检测的主要分析手段 普遍使用的硅胶基反向键合固定相表面存在残存的硅醇基或金属离子 如Fe3 A13 而四环素类抗生素易与金属离子鳌合 反向柱残存的硅醇基与四环素类抗生素可以通过氢键或离子交换作用 因此导致色谱峰拖尾 保留值不稳定或过长 出现峰形异常和分离度下降 为避免形成金属鳌合物和在反向LC色谱柱上的吸附 在反向LC中 优化流动相的组成是四环素类抗生素残留检测的重要方法之一 通常在流动相中加入酸 如磷酸 草酸 柠檬酸 酒石酸 EDTA等 有机改性剂 甲醇 乙睛等 离子对试剂掩蔽剂等 并以加草酸为多数 第二节大环内酯类抗生素 大环内酯类抗生素 MALs 作为抗生素的一个重要类别被广泛应用于医学与兽医学上对细菌感染的治疗或预防 这些化合物在结构上均具有一个高度取代的大内酯环结构 大多数的种类母体分属十四元和十六元大环两组 在20世纪50年代末 作为青霉素类化合物的替代品 红霉素就已经开始被使用于兽医临床 到现在已经有相当多品种的大环内酯类抗生素能够同时作为人用和兽医用药 还有一些品种的大环内酯类抗生素已作为禽畜专用的抗生素品种生产 利用其抗革兰阳性菌以及抗支原体活性对感染性疾病进行预防治疗和对亚临床疾病进行控制 还有一些类的大环内酯类抗生素具有其他独特的作用 比如泰乐菌素 螺旋霉素等除抗感染能力之外在低浓度下具有显著的促生长作用 是饲料中常见的促生长剂 美贝霉素类化合物以及其半合成的衍生物的抗寄生虫和节肢动物的特性成为重要的驱虫剂 那他霉素则具有明显的抗真菌效力 广泛应用于多种食品 特别是乳制品的防腐中 在畜牧和食品行业中大环内酯类化合物如此广泛的使用 也衍生出一些消极的后果 其中最为受人关注的是动物源病原菌抗药性的获得给动物 人类健康和环境带来了危害 在对大环内酯类抗生素作为饲料添加剂的风险防范上 欧盟走在了最前列 1997年欧盟对食品和动物饲料中的螺旋霉素和泰乐菌素颁布了禁令 1999年5月 欧盟采纳了SCAN 动物营养学科学委员会 的观点 同意应该尽可能减少 并且逐渐过渡到禁用可以同时作为医药和兽药用途的抗生素类饲料添加剂 到2006年1月 欧盟彻底禁用所有抗生素类的生长促进剂 三 分析与检测方法在色谱方法成熟完善之前 和其他绝大多数抗生素一样 这类药物的测定曾经采用过微生物测定法 这种方法在分析时间 分析成本 对目标物质的分离和确认能力 方法的定量能力上都有着明显的不足 也不能检测无活性的代谢产物 特别是在畜产品和食品中药物的残留分析领域中发挥的作用不大 分光光度法相对色谱方法有仪器简单 操作简捷 分析时间短而成本低廉的优势 因此在早期使用分光光度法建立过大环内酯的测定方法 但是 大多数大环内醋类药物的紫外吸收波长都不高于280nm 分光光度测量会被生物基体中的杂质所严重影响 近年以来 应用于食品样品中各种类大环内酯药物残留分析的方法 基本上都基于液相色谱方法及相关联用技术 一 薄层色谱一般用作食品样品分析的薄层色谱方法 都要对其中的大环内酯类化合物在预提取过程之后进行液液萃取净化 以去除其中亲脂性的各种杂质 防止干扰分析 薄层色谱分析大环内酯使用的固定相大多数是硅胶 采用较高极性的展开剂进行分离 乙醇一水 氯仿一甲醇一丙酮一甘油等 1 微生物分析法微生物法是一种传统的测定氨基糖苷类化合物和其他抗生素的分析方法 是英国 欧洲 美国 中国等国家和地区药典规定的测定药品中氨基糖苷类化合物的测定方法 2 气相色谱和气相色谱 质谱技术由于氨基糖苷类化合物的高极性和难挥发性 因此很少有利用气相色谱测定氨基糖苷类化合物 通常先进行硅烷化衍生提高化合物的挥发性 3 薄层色谱法薄层色谱被英国和欧盟药典规定为卡那霉素和新霉素的药品的鉴定方法 但是这种方法的灵敏度比较低 甚至低于生物检测法的灵敏度 由于氨基糖苷类化合物没有荧光 因此需要衍生测定 4 液相色谱法由于氨基糖苷类化合物的水溶性好 极性大 因此比较适合用液相色谱技术进行分析 目前有关的动物源性食品中氨