铅离子与牛血清蛋白相互作用的光谱分析—毕业答辩

铅离子与牛血清蛋白相互作用的光谱分析,2,目录（Contents）,3,1.引言1）实验目的：,分析铅离子和牛血清蛋白相互作用的光谱特征。探究不同的实验条件：pH、牛血清蛋白浓度、铅离子浓度、离子强度对铅离子-牛血清蛋白体系光谱的影响。探索最佳试验条件。,2）研究背景： 牛血清蛋白,在生物体中，蛋白质是极为重要的生命物质，在生命的运动和发展中起着关键的作用。有关蛋白质的组成、构象及与小分子相互作用机理的研究是目前从事化学、化学生物学、生命科学、药学和临床医学科技工作者共同关注和感兴趣的课题。,4,5,铅离子,铅是进行工业生产、科学研究不可缺少的物质之一，在人类的生产生活中起着重要的作用。铅又是对人类和高等生物中最具危害的有毒元素之一，铅污染问题己给人类造成了多种灾害。铅即可造福人类，又会造成环境的污染。因此，寻求高灵敏度和高选择性的检测方法对其进行检验，具有理论和实际的意义。,6,常用检测方法及其特点1）紫外吸收光谱分析,这是了解溶液中蛋白质分子构象的一种常规方法。具有灵敏度高、用量少的特点。观察牛血清蛋白的特征吸收峰是否发生位移或者峰值变化可粗略知道物质是否与BSA发生了作用。物质的紫外及可见光谱不能完全决定物质的分子结构，还必须与红外光谱或者质谱等分析方法综合运用，才可以得出可靠的结论。,Use this box to highlight,7,红外光谱法,红外光谱法是研究蛋白质二级结构和动力学特性的有效工具。具有特征性强，专一性高，定量范围广等特点。荧光光谱法灵敏度高选择性好，用量少，能提供较多的物理参数。但是适应性差，应用范围不够广泛，荧光对环境因素敏感。,8,2.实验部分,2.1 试剂2.2 实验器材2.3 实验试剂的配制2.4 Pb-BSA体系光谱分析,2.1实验试剂,BEA Confidential. | 9,10,2.2实验仪器,970CRT型荧光分光光度计,上海分析仪器总厂UV-7502PC型紫外-可见分光光度计，日本岛津电子天平, 北京赛多利斯仪器系统有限公司10-1000L移液枪Nicolet6700红外光谱仪，美国热电公司,2.3溶液的配制,缓冲液的配制BSA溶液的配制硝酸铅溶液的配制配制含不同浓度的铅离子的Pb-BSA体系配制含不同pH的Pb-BSA体系配制含不同浓度BSA的Pb-BSA体系,11,2.4光谱测定步骤：,荧光：激发波长设定为240nm，测量200-600nm处的荧光光谱。所有测量均在室温(152)下进行。激发和发射单色器狭缝均为5nm。紫外：均用二次蒸馏水建立基线。扫描范围200-600nm。红外：测定不同浓度铅离子下Pb-BSA体系的红外光谱图。,12,牛血清蛋白的红外光谱图,BEA Confidential. | 13,BSA酰胺I带红外吸收峰的归属,蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中多肽链本身的折叠方式比如 -螺旋、-折叠 、-转角等。,BEA Confidential. | 14,牛血清蛋白的酰胺I带红外光谱图,可以看到，酰胺I带的红外最大吸收位于1650cm-1附近，表明牛血清蛋白以-螺旋螺旋结构为主。,BEA Confidential. | 15,不同浓度铅离子下体系的红外二阶导数图,BEA Confidential. | 16,B-N铅离子浓度依次为110-6 mol/L，210-6 mol/L 310-5mol/L,210-4 210-3mol/L,从图中可以观察，-转角增加， -螺旋减小，-片层增加,17,2）不同pH下体系的紫外光谱图,1-6 pH:6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,18,从图中可以看出在pH=7.5时峰强度最弱。血清白蛋白在280nm附近的吸收峰是其肽链上2个色氨酸和19个酪氨酸残基的芳杂环的-*跃迁引起的，而240nm附近的吸收则主要是肽键 C=O基的 n-*跃迁引起，在 BSA等电点之后，随着体系中pH的降低，使得 BSA分子间作用增强，有利于分子间和分子内的团聚作用，使蛋白质分子的构象改变，-螺旋含量减少。同时由于体系pH值的降低，出现蛋白质肽链的伸展现象，血清白蛋白的结构改变，使得包围在白蛋白分子内部的色氨酸，酪氨酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，疏水基之间作用增强，跃迁能量增大。,不同浓度铅离子下体系的荧光谱图,19,1-7铅离子浓度分别为0，110-6mol/L，2 10-6mol/L，1 10-5mol/L，2 10-5mol/L，2 10-4mol/L，4 10-4mol/L,荧光：激发波长设定为240nm，测量200-600nm处的荧光光谱。所有测量均在室温(152)下进行。激发和发射单色器狭缝均为5nm。血清蛋白能够发出荧光是因为存在三种芳香族，氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸这些氨基酸的结构不同，造成荧光强度之比为100：9：0.5。从图中可知牛血清蛋白的发射波长在270nm铅离子浓度逐渐增加，发射峰发生蓝移，BSA的内源荧光强度有规律地降低，且发射峰的峰形均基本不变，说明铅离子对BSA有荧光猝灭作用。,4.结论,通过光谱分析可知，最佳的实验条件：pH=7.5,NaCl（离子强度）浓度为0.0045mol/L