液相色谱仪实用技术

第六章液相色谱仪实用技术-分析常见问题-仪器日常维护-仪器常见 故障-色谱柱的使用与保养,分析常见问题,基线噪音,可能的原因： 流动池脏 检测器灯有问题 如果是周期性的，电压或泵的脉冲 温度对检测器的影响 气泡经过检测器,基线漂移,可能的原因：梯度洗脱温度不稳定 (示差检测器） 流动相中有污染物柱中的流动相没有平衡体系中有污染物流出,鬼 峰,问题1- 流动相脏问题2- 容器污染问题3- 柱子污染,20% - 100% MeOH,没有进样,3,7,15,17,鬼峰即使不进样也会出现的峰,峰 型,可能原因：柱中有死体积过滤片部分堵塞只有一个双峰组分的共洗脱样品与溶剂不匹配，溶剂与柱子不匹配,双 峰,柱 塌 陷,可能原因：,峰 型,可能的原因：部分峰拖尾二次保留效应残留硅醇基的反应小峰紧跟在大峰的后面流出所有峰拖尾额外的柱效应柱坏/不适当的溶剂柱头有污染金属不适当的样品量,峰 型,可能的原因在大峰前，有小峰流出柱死体积样品溶剂不适当过滤片部分堵塞柱过载,峰 型,原因样品的吸收比流动相的吸收值低当样品组分通过色谱柱时打破了原来的平衡用示差检测器时是正常的,峰宽,* 在进样口到柱或柱到检测器之间，使用细的短的连接管* 保证所有的管路接头都使用正确* 用小体积检测池* 减少进样量或降低样品浓度,柱外体积增加,柱外体积效应的影响,压力,I. 不进样时柱压连续升高- 泵密封垫- 流动相有颗粒- 流动相溶解性- 流动相的不稳定性 (聚合)- 形成柱死体积 (与使用条件有关)II. 进样时压力升高- 样品有颗粒样品在流动相中不溶进样阀堵塞- 样品组分与固定相不兼容,保留值漂移,I. 所有峰都向低保留值方向漂移（酸、碱、中性化合物）- 键合相流失- 流动相不稳定 (可能性较小)- 溶剂输送系统 (流速变化)II.所有峰都向高保留值方向漂移- 在水/有机溶剂的混合体系中，有机溶剂含量减少- 柱改变 (可能性较小)- 溶剂输送系统 (流速变化)III.离子型化合物的色谱峰的保留值漂移-流动相中挥发性组分损失 (离子强度, pH 漂移)- 柱改变 (键合相或污染),保留值漂移,I. 与流动相有关的问题- 使用新鲜的流动相?pH?电导?色谱性能测试II. 与色谱柱有关的问题- 测试新柱- 用标准的测试混合样测试新柱- “清洗” 色谱柱后再测- 考虑样品基质与使用条件对柱稳定性的影响,液相色谱仪的日常维护,储液罐 使用HPLC试剂/溶剂 含缓冲盐的流动相过0.25m膜除去微粒物质 更换流动相时,应彻底清洗，防止交叉污染。 定期清洁储液器及附件，防止长微生物,输液泵, 流动相要过滤、脱气 密封垫易损坏引起故障,输液泵,每天实验结束一定要认真冲洗泵,注意防止堵塞 使用缓冲盐流动相时,更要小心。注意泵压力不要太高 要适当调整压力,一般压力上限在10-20MPa，下限为0.5MPa， 防止因泵堵塞造成压力过高损坏柱塞杆或烧坏电机,检测器（流动池）, 保持清洁，每天用后与色谱柱一起清洗 不定期用强溶剂反向冲洗检测器 使用脱过气的流动相，防止气泡滞留池内 检测器灯有一定寿命，平衡和清洗色谱柱时不要开灯。,流动池的清洗方法（尽量少用）,断开所有的管路，把针泵接到流动池的出口用10-20ml纯水冲洗流动池（要确认所用溶剂已洗干净）用10-20ml的20%硝酸冲洗流动池（可以适当停留30min左右）用3040ml左右纯水冲洗用1020ml左右甲醇冲洗用干净的气体吹干,进样阀,清洗 停机前一定冲洗干净进样器内残留的样品或缓冲盐，防止样品和无机盐沉积造成进样阀转子面磨损或堵塞注射器必须使用仪器专用进样器平头注射器,色谱柱防止柱性能下降,1、溶剂的化学腐蚀性不能太强；2、避免颗粒物在柱头沉降；3、柱压不能太高，防止冲击太大；固定相流失4、尽可能使用预柱5、色谱柱应在规定的pH范围内使用6、每天实验后清洗色谱柱柱；7、定期再生色谱柱8、长时间不用时要保存好,一定要洗去缓冲盐, 保存在甲醇或乙腈，将柱两端拧紧,保持 柱填料湿润。,记录器数据处理系统,色谱工作站: 防止网上病毒损坏软件记录仪: 热敏式打印头要注意记录纸的质量,开机前注意检查走纸部件,不要卡纸.,常见故障及解决方法,储液器,脱气不充分(噪声大，出毛刺) 用He脱气, 真空脱气, 超声脱气, 加热回馏脱气,(混合流动相不宜)流动相供给不畅，泵压力不稳 流动相接近用完 过滤器堵塞（有颗粒，长霉） 流速过高,阻力大,造成空化现象. 解决的办法是:降低流速;换大孔过滤器加大管路内径;抬高储液器.,储液器,储液器或流动相被污染 产生有规则的噪声； 基线上升，梯度洗脱出鬼峰；原因: 溶剂质量差（含杂质多）； 配流动相的玻璃器皿不合格,微生物影响； 配制流动相的操作不当（过滤、脱气、搅拌).,输液泵,单向阀球和阀座粘在一起，堵死，打不出溶剂，(缓冲盐流动相) 用高质量的溶剂冲洗，不同极性溶剂冲洗,如水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷，更换新单向阀。,输液泵,球和阀座密封不严，压力不稳，气泡进入阀中，紧贴在阀体内，使球难以返回阀座，引起倒流，压力和流速变化大，可能有小晶体颗粒。 清除气泡的办法：打开排液阀，大流量冲洗，用脱过气的甲醇冲洗，一般可解决问题。,输液泵,泵垫圈磨损或破碎：高压下压力不稳，从泵头往外渗漏流动相，色谱峰的保留时间会改变。 解决办法：更换新垫圈。更换方法按维修说明书上的方法一步步操作。注意： 输液泵的垫圈要和流动相匹配协调。多数垫圈和流动相是协调的,但有的垫圈适用于甲醇、水、乙腈，在四氢呋喃中溶解、变粘、变软。 一般应学会换密封垫圈。,输液泵,柱塞杆故障 磨损、漏液 使用不当被折断 柱塞杆被卡住，不能运动更换新柱塞杆 请维修工程师帮助解决，或参照专门的操作手册自己动手更换,进样系统手动进样系统器,渗漏 转子密封垫圈松紧不合适； 垫圈不配套； 组装不对。堵塞, 样品打不进去。 样品管堵塞：环管用反冲法或超声清洗排除（或换新管).,进样系统手动进样系统器,注样孔 装样时针头周围渗漏： 孔道堵塞，或者放空管和样品管太细，阻力太大 针头密封管规格不对，针头太细 注射孔渗漏： 放空管有虹吸现象，为防止虹吸,放空管末端应在放空瓶液面以上, 转子密封面上孔之间有磨损，更换磨损的转子. 样品滞留,进样系统手动进样系统器,阀在进样位置停留时间不够 要求停留时间至少应让流动相流过的体积是环体积的10-20倍。 (一般是在下一针进样前才将阀扳到装样位置)残留样品留在样品环中或注射器中，或从放空管中虹吸回来,污染下一个样品 可用5-10倍的流动相或新样品冲洗注射孔和注射器,若是虹吸,应加限制管。管路接头有死体积滞留样品，很难冲洗干净 应检查装配情况，确定是否需换新配件,进样系统自动进样系统,样品瓶不配套 瓶小针弯、折断 瓶大样品少，抽不上样 瓶破碎 更换合适的样品瓶进样器针头堵塞（样品、缓冲盐、隔垫碎片、针头本身)， 可用溶剂清洗，金属丝疏通，或换新针头,进样系统自动进样系统,注意样品瓶隔垫，防止污染样品滞留：空白溶剂出色谱峰 加倍清洗 调整进样顺序，从低浓度开始，高浓度放后面 在样品瓶前放清洗液瓶,色谱柱,塔板数下降 样品处理不合适，选择适当的样品净化方法，选择合适流动相 柱头塌陷，填装修补峰形变坏 出现拖尾峰，分叉峰，非高斯峰，与塔板数下降有关 峰形坏保留时间不变，可能是柱堵塞(不锈钢烧结片)，或柱头有空穴,色谱柱,柱压突然增大 滤片被流动相或样品中颗粒堵住 用025m滤膜除去微量杂质 样品沉积在柱内,用能溶解样品的溶剂冲洗（断开柱和检测器的连接） 可正向冲，反向冲 柱内硬件有问题：滤片堵塞，换新片或清洗塌陷，用相同填料填充、修补,使用1：1的硝酸溶液超声清洗5min，再用水、甲醇清洗除去水份,色谱柱,柱压突然增大（续） 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长,色谱柱,保留时间改变 不同柱保留时间的变化,主要是填料差异造成的 不同牌号柱出峰顺序不变，保留时间有小的变化 若峰顺序变化，保留时间变化较大 考虑换柱或优化分离条件 对专门的分析最好用同一批号的柱子,色谱柱,新柱柱效低 柱外死体积大 样品在流动相中溶解不好，影响传质过程 方法: a、更换连接管，重新连接色谱柱，降低死体积 b、使用合适的流动相或使用流动相溶解样品,色谱柱,旧色谱柱柱效低，分离不好，柱入口床层塌陷 填料被流动相溶蚀而流失方法： 用同型填料填补柱效可部分恢复 对硅胶质填料，流动相PH值在27范围内，否则可能被溶蚀,色谱柱,旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰 柱柱入口填料被污染变质 方法： 用强溶剂冲洗 刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效 可部分恢复 污染严重，则废弃或重新填装 g,色谱柱, 新柱接到仪器上后，柱头漏液 柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够 用扳手顺时针方向拧紧14圈直到不漏液为止 新柱接到仪器上后，启动仪器没有柱压降W 柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干 继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉,色谱柱,新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现。b 柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干 流动相脱气不彻底特别是MeOHH20体系由于氢键作用很容易出现气泡。 方法： 继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉 配好流动相后一定要进行脱气处理,色谱柱,新柱接到仪器上后柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限 柱入口滤片被固体颗粒堵塞 柱入口滤片被霉菌堵塞方法： 更换或清洗柱入口滤片 用0.25m过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。,色谱柱,进样次数增加柱压降逐渐增加 样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物 样品在流动相中析出微小结晶方法： 用0.25m过滤膜过滤样品 推荐使用流动相溶解样品。,色谱柱,使用段时间后，柱效下降，分离不好# 柱填料被流动相溶解而流失 柱填料被样品杂质污染方法： 推荐使用预柱 如柱床层塌陷，用相同型号填料填补 推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质,色谱柱,柱使用一段时间后，柱效下降出现双峰 柱入口床层被污染使柱填料变质 用强溶剂冲洗除去杂质 柱使用段时间后，柱效下降，出现峰拖尾 柱入口床层被污染 用强溶剂冲洗20-30ml，若效果不明显应废弃,色谱柱, 进样量增大与峰面积增加不成正比，即进样量与峰面积不是线性关系。,Pl 样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲入色谱柱中，而另一部分则沉积在柱入口端方法： 用流动相溶解样品 样品的浓度不宜太大 进样量不宜过大,色谱柱, 使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快 霉菌生长所致方法： 在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长 实验结束后按要求用MeOH和水冲洗后关机,色谱柱,用5m颗粒填料柱时， 以MeOHH20作流动相柱压较高79-M-# MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大 可用乙腈水体系使柱压降低，分离效率更好。 长时间放置的色谱柱，出现双峰 柱床层出现干裂 柱放置时，最好使用相应的溶剂充填好，防止受大的机械震动，如床层干裂应废弃掉,色谱柱,流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰 强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来，不影响柱的性能 柱使用一段时间后保留值逐渐缩短。 柱中固定相流失所致 方法： 更换色谱柱 检查所用的色谱条件是否合适,色谱柱, 在U V色谱图中，靠近死时间处出现负峰 进样时压力波动所致 样品溶液比流动相的UV吸收值低方法： 采用阀进样 用流动相溶解样品,由色谱柱引起的故障,检测器紫外可见光检测器,灯故障:基线噪声大,灵敏度低, 氘灯寿命:1000h 汞灯和钨灯寿命:2000h 一般使用6个月以上可能接近寿命期限,可以考虑更换新灯,检测器紫外可见光检测器,流动池 流动池内有气泡 用脱气甲醇，不同流量冲洗 池堵塞（入口、出口、池内） 用可溶堵塞物的溶剂冲洗 （缓冲盐用水冲洗） 池污染 异丙醇、二氯甲烷、 6mol/L HNO3 冲洗,检测器紫外可见光检测器,测量池和参比池失配 UV以空气为参比，一般不扣流动相本底 若用有紫外吸收的流动相，参比信号不为零，会出现倒峰和伪峰。此时，选择合适的流动相。,检测器紫外可见光检测器,时间常数选择：（过滤噪声） 有的仪器有固定的时间常数，有的需设置时间常数。 时间常数太小, 噪声增大; 时间常数太大,出现宽峰、拖尾或矮峰。 时间常数的设置一般根据经验估计，小颗粒柱常数小，可选最窄峰宽的1/10作为时间常数,对4.6(150-250)mm，5um柱，可选0.5s or1s,检测器 非线性响应,超出线性范围 样品量太大 检测器的衰减超出了其线性动力学范围 流动相的紫外吸收比较强,检测器 温度影响, 环境温度变化引起基线漂移 流动相温度变化引起折射率改变，紫外光传导变化 柱温变化引起基线漂移,检测器信号线故障,记录仪和数据处理系统信号线插接不紧,接触不良，信号很弱，出现不需要的噪音,此时按说明书检查线路连接。地线对仪器很重要, 仪器外壳和信号线的接地很严格，接地不良会出现较大的基线噪声，接错线会造成短路，烧毁仪器。,检测器 波长问题,次级发射效应：用氘灯作可见光范围的光源时会发生次级发射效应，用钨灯没有此影响.正确选择波长:既照顾到灵敏度,有考虑到稳定性 波长校准：机械转动光栅选择波长,因磨损造成所选波长与刻度盘上的不一致，而且重复性也差。可用波长溶液校准：235、257、315、350nm 。,色谱柱的使用及保养,色谱柱与仪器的联接,不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时,会造成：色谱峰展宽(死体积)致使柱效下降或渗漏解决办法 自制相应的转换接头 使用“通用”型接头（锥箍及螺母）,这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即stop-depth的长度可调，能换接不同的色谱系统及色谱柱。如PEEK工程塑料的接头,色谱柱与仪器的联接,各种锥箍和管路接头长度示意图图:,色谱柱与仪器的联接, Stop_depth长度不合适造成柱前死体积,锥箍,色谱柱与仪器的联接,锥箍锥度不合适造成渗漏:,测柱效-良好的色谱实验习惯, 拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录 色谱测试条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽,测柱效的方法,色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同 各色谱柱均附有说明书,可按说明书所述方法测定 例：Waters反相C18柱的测定方法 流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min 样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈, 加入600l丙酮 进样量5l 检测波长:254nm,计算色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式：W 方法Wtan 16 切线法Wh 5.54 半峰高W3 9 3W4 16 4W5 25 5,不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来,色谱柱的正确使用及操作, 流动相的转换 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱样品及溶剂的要求 记住拿到一根从未用过的色谱柱时一定要先看其使用说明！,正确使用色谱柱（一）,样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用,正确使用色谱柱（二）, 流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例,色谱柱的在线保护装置,给色谱柱提供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染装置 在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱,在线过滤器,防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效 在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）可更换的消耗品 更换滤芯 更换垫圈,保护柱,可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时 保护柱的种类 普通自装填料的保护柱 影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大 有各种填料的预装柱供选择，使用方便 填料容积较小，会引起柱效降低,色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 记住每种色谱柱可能有特定的方法一定 要先看其使用说明！,反相C18色谱柱的清洗,在流动相中添加了一些酸、碱或缓冲盐后一般的冲洗方法：第一步：用和流动相相同比例的水和有机相冲洗第二步：增大水的比例到90%95%（最好用梯度）第三步：增大有机相比例到100%（最好用梯度） 最后保存在有机相（甲醇或乙腈）中,色谱柱的存放,存放前的处理 除去杂质、缓冲盐合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干涸 避免机械震动 防止细菌