《分子遗传学3纸板》PPT课件.ppt

第三章DNA的复制 复制 replication 是指以原来的DNA分子作为模板合成出相同分子的过程 复制在保持生物稳定性方面起重要作用 复制是细胞分裂的前提和基础 复制是精确的复制 一般不会差错 复制方式为半保留复制 semiconservativereplication 第一节半保留复制的验证 半保留复制 亲代DNA的两条链解开 每条链都作为模板形成两个子代DNA分子 新合成的每个子代DNA分子中 一条链来自亲代DNA分子 另一条链是新合成的 半保留模型 semioconservetivemodel 全保留复制模型 conservetivemodel 分散模型 Dispersivemodel 验证半保留复制的实验 Meselson Stahl实验Taylar实验姐妹染色单体差别染色方法Cairns复制模型 型复制 第二节复制的起点 方向和终点 一 研究方法 1 用同位素标记电镜观察 1973年R L Rodrigue等提出的 验证了E coli环状DNA是双向复制 一个复制起点 且终点在起点对面 2 用噬菌体插入标记法同步培养不同步培养3 变性定性法4 双向电泳法 二 原核的复制起点和方向 复制起点 origin ori DNA分子上特定的发动复制的起始位点 复制终点 terminus DNA分子上复制终止的位点 复制子 replicon 从复制起点到复制终点这样一个完整的DNA单位称为复制子 原核细胞基因组实质为一条双链DNA分子 作为一个复制子 整个基因组的复制起始于单一位点 起点 真核细胞基因组庞大 有多个复制起点和复制终点 含有多个复制子 复制的特点 E coli定点 双向对称复制 T7 噬菌体 在近一端的17 处开始 向两端延伸 枯草杆菌有固定的起始点 双向不对称复制 一侧复制基因组的4 5 另一侧只复制1 5 终点也不在Ori的对面 质粒R6K早期为单向复制 复制了约1 5基因组时进行双向复制 质粒ColE1有固定起始点 但却为单向复制 mt 线粒体 DNA进行D displacedloop 环复制 8 D 环复制时需合成引物 mtDNA为双链 第一个引物以内环为模板延伸 至第二个复制起始点时 又合成另一个反向引物 以外环为模板进行反向的延伸 最后完成两个双链环状DNA的复制 复制中呈字母D形状而得名 dNTP DNA pol 复制过程在研究真核细胞内线粒体DNA的复制时 发现了DNA的D环复制 复制过程四阶段 D环复制的特点是两条链的复制不是同步的 1 H链首先合成 在复制起点处以H链为模板 合成 RNA引物 然后由DNA聚合酶 催化合成一个500 600bp长的H链片段 该片段与H链以氢键结合 将亲代的L链置换出来 产生D环复制中间物 新的H链DNA片段由于分子3 端终止的位置不定而长短不一 也有一些3 端位置是固定的 而由于5 端被降解而使整个DNA片段长短不一 合成这样500 600bp长的DNA片段不会引起线粒体DNA超螺旋结构的明显改变 2 H链片段的继续合成 上述产生的H链片段由于太短而很容易被挤出去恢复线粒体DNA完整的双螺旋结构 但有时这个片段会继续合成 这需要依靠拓扑异构酶和螺旋酶的作用将双链打开 3 L链合成开始 以被置换下来的亲代L链为模板 离H链合成起点60 基因组的位置开始合成L链DNA 合成也需要RNA引物 4 复制的完成 H链的合成提前完成 L链的合成随后结束 线粒体DNA合成速度相当缓慢 约每秒10个核苷酸 整个复制过程需要1个小时 刚刚合成的线粒体DNA是松弛型的 需要40分钟将其变成超螺旋型 考察基因功能的常用方法 突变体的表型变化突变型可分为二类 一类为可以补偿的 另一类为不可补偿的 考察复制有关酶的常用突变型 温度敏感突变体此突变体属于条件致死突变型 即 在25 正常生长 42 不能生长致死 第三节原核生物复制的酶系统 利用大肠杆菌温度敏感突变体研究与复制有关基因 dna 一般复制的过程包括 起始 延伸和终止3个阶段 每一阶段的蛋白质和酶不完全相同 可利用如下2种突变体来筛选 快停突变体 温度升高 42 45 复制立即停止 缺失复制体组分的酶 特别是延伸的酶或参与供应关键前体的酶 dna突变体慢停突变体 在非允许温度下 42 45 可以完成当前的复制 但不能开始新的复制 缺失复制起始有关的酶 一 DNA聚合酶 DNApolymerase 全称 依赖DNA的DNA聚合酶 DNA dependentDNApolymerase 简称 DNA pol DNA聚合酶的共同特点 需要提供合成模板 不能起始新的DNA链 必须要有引物 一小段DNA或RNA 提供3 OH 在此基础上聚合添加 合成的方向都是5 3 即子链是5 3 除聚合DNA外还有其它功能 如校对 修复等 E coli中主要的三种DNA多聚酶 一 DNA聚合酶I 发现 西班牙裔美国人A Kornberg等在1956年完成第一例体外合成DNA实验 从大肠杆菌中分离得到一种酶 此酶可以将核苷酸共价连接在一条已经存在的DNA链上 称此酶为DNA聚合酶I或Kornberg酶 15 单一肽链的大分子蛋白质 分子量约为109KD 每个细胞中大约存在400个 DNA pol 109kD DNA聚合酶I的结构 要求 由PolA基因编码的单个肽链 MW 103KD可被枯草杆菌蛋白切成2个片段 小片段位于N端35KD大片段位于C端68KD即Klenow片段DNA聚合酶I有6个结合位点 模板结合位点 有引物的ssDNA 有缺口的dsDNA 引物结合位点 引物可以是一小段DNA或是RNA 引物3 OH结合位点 底物dNTP结合位点 5 3 外切酶结合位点 位于N端小片段 3 5 校正位点 靠C端大片段偏中间部位 17 323个氨基酸 小片段 5 3 核酸外切酶活性 大片段 Klenow片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性3 5 核酸外切酶活性 N端 C端 DNA pol DNA聚合酶 的功能 要求 对复制中的错误进行校读 对复制和修复中出现的空隙进行填补 1 5 3 聚合功能 主要用于DNA的修复和后随链中RNA引物的置换 2 3 5 外切活性 主要起校正功能 切除合成中错配的碱基 3 5 3 外切活性 1 切口平移 nicktranslation 2 链的置换 3 模板转换 template switching 4 内切酶活性 主要用于切除修复系统 正常复制中无 19 二 DNA pol 120kD DNA pol 基因发生突变 细菌依然能存活 DNA pol 对模板的特异性不高 即使在已发生损伤的DNA模板上 它也能催化核苷酸聚合 因此认为 它参与DNA损伤的应急状态修复 三 DNA多聚酶 发现 针对一株dnaE基因缺失突变型的研究 其在25 可以正常生长合成DNA 当转移至43 时 DNA的复制过程终止 这表明dnaE的表达产物是DNA合成所必需的 证实dnaE基因的编码产物是DNA聚合酶III的 亚基 其具有5 3 聚合酶活性 21 DNApol 830kD 功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶 22 由十种亚基构成的不对称异二聚体 5 3 聚合酶活性 3 5 外切酶活性和碱基选择功能 维系二聚体的作用 DNA多聚酶 结构组成如下图 全酶在DNA上的装配分为三个阶段 一个 二聚体加上一个 复合体识别引物模板形成一种前起始复合物 DNA在与 复合体结合的位点构象发生改变 而对核心酶产生了高亲和力使核心酶能与DNA结合 二聚体结合核心聚合酶 使其二聚化 DNA多聚酶 的功能 5 3 聚合酶功能 能催化DNA沿5 3 方向延长对模板要求高 仅有缺口 100nt的dsDNA才可做模板 3 5 外切酶活性 与DNA聚合酶I相同 有校对功能 5 3 外切酶活性 与DNA聚合酶I不同 仅能以单链为底物 不能进行缺口平移 DNA多聚酶 是合成DNA的主角 一般合成长片段如前导链和后随链冈崎片段的合成 26 原核生物的DNA聚合酶 27 常见的真核细胞DNA聚合酶 二 DNA连接酶 DNAligase 作用是连接DNA分子 将相邻的3 OH和5 P连接成磷酸二酯键 封闭缺口 其作用过程分三步进行 1 E ATP E AMP ppi在E coli中 E NAD E AMP NMN2 E AMP上的AMP转移到DNA的5 PO4上使其活化 3 活化的5 PO4与相邻的3 OH作用形成3 5 磷酸二酯键 并释放出AMP 此酶在后随链的合成 DNA的损伤修复 重组及转座中发挥重要的作用 29 需一段DNA片段具有3 OH 而另一段DNA片段具有5 Pi 需要消耗能量 在原核生物中由NAD 供能 在真核生物中由ATP供能 未封闭的切口位于双链DNA中 即其中有一条链是完整的 DNA连接酶的催化特点 30 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用 在DNA修复 重组及剪接中也起缝合缺口作用 是基因工程的重要工具酶之一 DNA连接酶的作用 三 螺旋酶 helicase 又称解旋酶 是解开氢键促进DNA的两条互补链分离的酶 是DNA复制 重组 修复过程中关键的发动蛋白 具有依赖DNA的ATPase活性 利用ATP水解产生的能量解旋DNA并使螺旋酶沿DNA链移动 一般每解开一对碱基需要水解一个ATP 与产物单链DNA结合 如螺旋酶 螺旋酶 螺旋酶仅仅催化DNA双链的分离 常与SSB蛋白结合如E coli中rep蛋白 螺旋酶 四 单链结合蛋白SSB singlebindingprotein 单链结合蛋白 又称双螺旋去稳定蛋白 helixdestabilizingprotein 可以结合单链 防止形成双链或发夹结构 同时保护单链 不被核酸酶水解 在E coli中 SSB是由177个aa组成的蛋白质 以四聚体存在 分子量为74KDa 结合单链DNA可覆盖32nt 保护DNA 在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应 第一个SSB的结合能力是1 则第二个SSB的结合能力为1000 1 SSB之间的相互作用 2 第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构 真核生物的复制系统中具有复制因子A RF A 相当于SSB 但无协同作用 34 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部 只有把DNA解成单链 它才能起模板作用 DNA复制的拓扑性质 五 拓扑异构酶 35 DNA复制时 两条链打开 必然造成DNA分子形成缠绕 打结 连环等现象 从而产生扭曲张力 闭环状的DNA按一定方向扭转形成超螺旋 盘绕过分称为正超螺旋 盘绕不足为负超螺旋 复制时 部分DNA要呈松弛状态 36 拓扑异构酶的作用特点 既能水解 又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶 拓扑异构酶 拓扑异构酶 分类 拓扑异构酶 topoisomerase 拓扑异构酶 催化DNA环的拓扑异构体之间转化的酶 它可以在切割DNA的单链或双链后 催化一个DNA分子单链或双螺旋链穿过断裂的单 双 链再重新闭合 37 DNA拓扑异构酶的作用机制 38 小结 参与DNA复制的酶和蛋白质 主要成员 功能 DnaA识别复制起始位点 解螺旋酶解开DNA双链 SSB维持已解开单链DNA的稳定 引物酶合成RNA引物 拓扑异构酶使打结 缠绕 正超螺旋的DNA松驰 DNA pol DNA复制延长中起主要作用 DNA pol 水解引物 填补空隙 修复作用 DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接 第四节原核生物和病毒的复制 原核细胞染色体DNA的复制起始于固定位点 双向复制 噬菌体 病毒核酸的复制可以起始于不同位点 双向或单向复制 也可以采取特殊的复制方式 如滚环复制 大肠杆菌 环状DNA分子F质粒 F因子 环状DNA分子 噬菌体 有环状DNA分子也有线状DNA腺病毒 线状DNA分子 40 DNA复制时 在DNA合成的复制叉上 分布有各种各样与复制有关的酶和蛋白因子 它们构成的复合物称为复制体 DnaA DnaBDnaC DNA拓扑异构酶 引物酶 SSB 3 5 3 5 复制体结构的变化形成复制的不同阶段 大肠杆菌DNA的复制分为三个阶段 起始 延伸和终止 一 大肠杆菌环状DNA复制的过程 41 需要解决两个问题 1 DNA解开成单链 提供模板 2 合成引物 提供3 OH末端 一 起始阶段 42 1 解旋解链 形成复制叉 复制起始位点oriC的结构特点 E coli的复制起点跨度为245bp包括3组13bp串联重复序列和2对9bp反向重复序列作为蛋白结合位点 富含A T 这可能和双链易于解开起始复制有关 44 DnaA蛋白识别并结合到复制起始位点 ori 的9bp重复序列 20 40个DnaA蛋白各带一个ATP相互靠近与DNA形成类似核小体的结构 解旋解链 45 形成的复合物促使邻近的3个串联重复序列解链 解螺旋酶 helicase DnaB 六聚体在DnaC蛋白协同下 结合到开链的中间复合物上 解开双链 形成两条单链DNA 并逐步置换出DnaA蛋白 单链DNA结合蛋白 SSB 四聚体结合在两条单链DNA上 使复制叉保持适当长度 47 含有解螺旋酶 DnaB蛋白 DnaC蛋白 引物酶 DnaG蛋白 和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体 primosome 2 引发体组装和引物合成 DnaA DnaBDnaC 引物酶 SSB 3 5 3 5 48 引物酶催化合成短链RNA引物分子在引物酶的催化下 以DNA为模板 合成一段短RNA片段 从而获得3 端自由羟基 3 OH 3 OH 5 3 5 3 5 引物 引物酶 DNA拓扑异构酶 DnaBDnaC SSB 解链是一个高速的反向旋转 其下游势必发生打结现象 因而需要DNA拓扑异构酶参与 50 复制的延长指在DNA聚合酶催化下 以亲代DNA链为模板 从5 3 方向聚合子代DNA链 其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上 磷酸二酯键不断生成 在原核生物中 参与DNA复制延长的是DNA聚合酶 二 复制的延长过程 领头链连续复制 随从链不连续复制 半不连续复制 在DNA的双向复制中 其中先导链是沿着复制叉进行延伸 为连续复制 后滞链是逆复制叉方向进行不连续复制 每次合成的DNA为一个岗崎片段 约1000 2000nt DNA的这种复制方式称为半不连续复制 DNA的复制方向为5 3 岗崎片段的大小约为1000nt 每个岗崎片段的合成都包括新一轮的起始发动的过程 岗崎片段间的缺口由DNA聚合酶 催化填充 DNA连接酶连接间断点DNA 形成完整的DNA链 后随链的合成过程 不连续复制模型 1968年日本的冈崎等提出 做了2个实验 脉冲标记实验和脉冲追踪实验 验证 复制出的DNA片段长约1000 2000nt 半不连续复制模型 1978年B M Olivera提出 前导链的合成是连续的 后随链的合成是不连续的 片段的形成是因为DNA中U的混入 被尿嘧啶N 糖苷酶切断所致 复制体和回环模型 复制体 由解旋酶 引发酶和DNA聚合酶III全酶组成的复合体 在DNA合成中沿着复制叉的方向推进 回环模型 复制体中 后随链模板形成一个回环 使环中RNA引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致 以适应双链在同一复制体上进行复制 后随链的合成过程 53 催化领头链和随从链是在同一DNA聚合酶 的催化下延长的 Pol 为不对称二聚体 一个作用于前导链 另一个作用于随从链 loop 在DNA聚合酶 的作用下 领头链合成1000 2000个核苷酸后 随从链开始合成 岗崎片段的长度为1000 2000个 大肠杆菌 54 原核生物基因是环状DNA 双向复制的复制片段在复制的终止点 ter 处汇合 ori ter E coli 72 32 1 去除RNA引物 填补缺口2 把DNA连接成完整的子链 终止的任务包括 三 复制的终止过程 切除引物 填补空缺 连接切口 E coli的复制终止现已发现有两对终止区域 terE D A和terC B 位于相遇点的两侧约100Kb处 每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的 ter顺序有一个23bp的区域 在体外可导致复制的终止 但其功能显示了一定的方向性 终止需要tus terminusutilizationsubstance 基因的产物Tus 36kD Tus能识别ter保守顺序 并阻止复制叉继续前进 ter Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来封闭复制叉的通路实行终止 56 在复制过程中形成的RNA引物 需由RNA酶来水解去除 RNA引物水解后遗留的缺口 由DNA聚合酶 原核生物 催化延长缺口处的DNA 直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口 1 去除引物 填补缺口 57 在DNA连接酶的催化下 生成最后一个磷酸酯键 将冈崎片段连接起来 形成完整的DNA长链 2 连接冈崎片段 58 复制起始 解链过程 DnaA DnaB 解螺旋酶 DnaC 引物酶加入 形成引发体 合成引物 拓扑酶 SSB的参与 2 复制延长 DNA pol 起主要作用 子链延长方向5 3 领头链连续复制 随从链形成冈崎片段 3 复制终止 RNA酶水解引物 空缺由DNA pol 催化合成DNA填补 DNA连接酶连成完整的子链等 原核生物复制小结 二 滚环复制 rollingcirclereplication 滚环复制 是小分子量的环状DNA分子所采取一种特殊复制形式 在滚环复制中 先导链借助模板环的滚动复制产生环状分子拷贝 1968年Gilbert提出滚环复制模型 1 一条链断裂 产生自由3 OH末端 2 只有一个复制叉 3 不需RNA引物 在正链3 OH上延伸 4 可形成多联体 concatemer 5 模板链和新合成的链分开 进行滚环复制的DNA分子类型 真核rDNA的扩增 细菌F因子DNA的转移 噬菌体裂解途经的复制 X174 M13 G4等病毒的复制 如 X174为单链环状DNA噬菌体 为单正 链 其复制第一步是合成一条互补的负 链产生双链环 第二阶段复制进行滚环复制 三 线状DNA复制起始及末端补齐 线性双链DNA的复制有的是从一端开始的 称为末端起始复制 如腺病毒 Adenovirus 29DNAs 脊髓灰质病毒 poliovirus 腺病毒DNA全长35937bp 线性双链 两端各有反向重复顺序103 162bp 两末端各有50bp为复制起点 其复制是以单链置换 stranddisplacement 形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的 线性双链DNA复制的末端补齐 腺病毒利用末端蛋白代替RNA引物 真核生物染色体的末端依赖端粒酶的特殊功能 第五节真核细胞DNA的复制 真核细胞中染色体DNA的复制是通过许多独立的复制子 复制元 来完成的 每个复制子都有固定的复制起点 采用双向复制 染色体DNA为线性分子 各复制子不一定同时活化 但在细胞的一个分裂周期内只能复制一次 复制的调控机制尚不清楚 对真核细胞DNA的复制研究常以感染宿主细胞的病毒 SV40 复制为基础 因为两者的复制有相似之处 65 一 真核生物复制的起始与原核基本相似 真核生物每个染色体有多个起始点 是多复制子复制 复制有时序性 即复制子以分组方式激活而不是同步启动 复制起始点比原核生物短 富含AT 称为自主复制序列 ARS autonomousreplicationsequence 66 多起点 双方向 真核生物 从起点开始 以双向等速进行 一个DNA分子上有许多个特定的复制起点 67 真核生物所含的DNA聚合酶种类更多 真核生物DNApol已发现有5种 分别命名为 DNA pol 起始引发 有引物酶活性 延长子链的主要酶 有解螺旋酶活性 参与低保真度的复制 应急修复 在复制过程中起校读 修复和填补缺口的作用 在线粒体DNA复制中起催化作用 DNA pol DNA pol DNA pol DNA pol 68 增殖细胞核抗原 PCNA 在复制起始和延长中起关键作用 PCNA为同源三聚体 具有与E coliDNA