《初级分离技术》PPT课件.ppt

第四章初级分离技术 一 初级分离 1 何为初级分离 初级分离是指从菌体发酵液 细胞培养液 胞内抽提液 细胞破碎液 及其他各种生物原料初步提取目标产物 使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程 一 初级分离 2 在初级分离中常用的相关技术 沉淀分级 泡沫分离 膜分离 萃取 吸附分离 2 1何谓沉淀分级 2 1 1定义 是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低 生成固体凝聚物的现象 沉淀与结晶的区别 2 1 2特点优点 操作简单 经济 浓缩倍数高缺点 针对复杂体系而言 分离度不高 选择性不强 2 1 3蛋白质表面特性 1 蛋白质是两性高分子电解质 主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成 疏水性氨基酸残基形成亲水性氨基酸残基蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区 亲水区和疏水区 2 蛋白质相对分子质量在5000 1000000之间 分子直径约1 20nm 蛋白质的水溶液呈胶体性质 3 蛋白质分子间的静电排斥作用 形成了双电层双电层厚度 电位 水化层蛋白质胶体溶液双电层 2 1 4常用沉淀方法的分类 1盐析沉淀 Saltinducedprecipitation 1 盐溶 Saltingin 在低浓度的中性盐存在下 蛋白质 酶 等生物大分子物质在水溶液中的溶解度增大的现象 Atlowconcentrationofthesalt solubilityoftheproteinsusuallyincreasesslightly ThisistermedSaltingin 盐析沉淀 Saltinducedprecipitation 2 盐析 Saltingout 在高浓度的中性盐存在下 蛋白质 酶 等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低 产生沉淀的过程 Athighconcentrationsofsalt thesolubilityoftheproteinsdropssharply ThisistermedSaltingoutandtheproteinsprecipitateout 3 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态 两性电解质 由于静电力的作用 分子间相互排斥 形成稳定的分散系蛋白质周围形成水化膜 保护了蛋白质粒子 避免了相互碰撞 3 盐析原理 低盐溶度下 发生盐溶 是因为 无机盐离子在蛋白质表面上吸附 使颗粒带相同电荷而互相排斥 无机盐离子增加了蛋白质的亲水性 改善了与水膜的结合 增加了蛋白质分子与水分子的相互作用力 使溶解度增大 3 盐析原理 盐析过程 随着中性盐的加入 蛋白质分散体系出现盐析现象原因如下 A 无机离子与蛋白质表面电荷中和 形成离子对 部分中和了蛋白质的电性 使蛋白质分子之间的排斥力减弱 从而能够相互靠拢 B 中性盐的亲水性大 使蛋白质脱去水化膜 疏水区暴露 由于疏水区的相互作用导致沉淀 4 影响盐析的因素 盐的种类和浓度 离子半径小 带电荷多的离子盐析效果好溶质种类的影响溶质浓度的影响 样品溶度0 5 2 蛋白质浓度大 盐的用量小 但共沉作用明显 分辨率低 蛋白质浓度小 盐的用量大 分辨率高 4 影响盐析的因素 pH值 影响蛋白质表面净电荷的数量 通常调整体系pH值 使其在pI附近 盐析温度 大多数情况下 高盐浓度下 温度升高 蛋白质失水 蛋白质的溶解度反而下降 操作条件应温和 一般在较低温度下进行 5 盐析用盐的选择 在相同离子强度下 盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异 一般的规律为 半径小的高价离子的盐析作用较强 半径大的低价离子作用较弱阴离子 P04 SO4 CHCOO Cl NO3 ClO4 I SCN阳离子 NH4 K Na Mg 3 2 2 选用盐析用盐的几点考虑 盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度溶解度受温度影响较小盐析用盐必须是惰性的盐溶液密度不高 以便蛋白质沉淀和离心分离来源丰富 经济 6 常用的盐析用盐 硫酸铵 溶解度大 25 767g L 硫酸钠磷酸盐柠檬酸盐 7 盐析用盐的用量选择 饱和度的概念 以硫酸铵为例 25 时 硫酸铵的饱和溶解度是767g L 定义为100 饱和度 如果沉淀某一种蛋白质需要60 饱和度的硫酸铵 那么需要硫酸铵固体的量是多少 硫酸铵盐析操作 硫酸铵固体加入法 通常在搅拌下 以少量多次方式缓慢加入 待加入的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵 当蛋白质溶液体积不大 所需调整的硫酸铵浓度不高时 可采用 硫酸铵固体加入法 硫酸铵盐析操作 饱和溶液加入法 较温和的方法 加入饱和的硫酸铵溶液 饱和的硫酸铵溶液的配制 一定量的水中加入过量的硫酸铵 加热至50 60 保温数分钟 趁热过滤 在0 或25 平衡1 2天 有固体析出时即达100 饱和度 不同饱和度所需加入的量可用公式计算 S1 原溶液的硫酸铵饱和度S2 要达到的硫酸铵饱和度S3 加入的硫酸铵饱和度 通常为 盐析沉淀后 需进行脱盐处理 再进行后续操作脱盐 透析 透析袋 半透膜 超滤 2有机溶剂沉淀 2 1概念 在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂 降低溶质的溶解度 使其沉淀析出 原理 1 降低了溶质的介电常数 使溶质之间的静电引力增加 从而出现聚集现象 导致沉淀 2 由于有机溶剂的水合作用 降低了自由水的浓度 降低了亲水溶质表面水化层的厚度 降低了亲水性 导致脱水凝聚 2 2常用的有机溶剂沉淀剂 乙醇 沉淀作用强 挥发性适中 无毒 常用于蛋白质 核酸 多糖等生物大分子的沉淀丙酮 沉淀作用更强 用量省 但毒性大 应用范围不广要求 致变性作用要小 毒性要小 挥发性适中 水溶性要好 2 3有机溶剂沉淀的特点 分辨率高溶剂容易分离 并可回收使用产品洁净 无需脱盐等容易使蛋白质等生物大分子失活应注意在低温下操作 有机溶剂预冷 成本高 2 4影响有机溶剂沉析的主要因素 温度 低温有利于防止溶质变性 有利于提高收率 溶解度下降 搅拌速度 散热溶液pH值 pI 2 4影响有机溶剂沉析的主要因素 样品浓度 稀 溶剂用量大 回收率低 但共沉淀作用小浓 节省溶剂用量 共沉作用强 分辨率低金属离子的助沉析作用 Zn2 Ca2 可减少有机溶剂的用量 3等电点沉淀法 3 1原理 蛋白质是两性电解质 当溶液pH值处于等电点时 分子表面净电荷为0 双电层和水化膜结构被破坏 由于分子间引力 形成蛋白质聚集体 进而产生沉淀 3 2概念 调节体系pH值 使两性电解质的溶解度下降 析出的操作称为等电点沉淀 由于在等电点附近 溶质仍然有一定的溶解度 等电点沉淀法往往不能获得高的回收率 因此等电点沉淀法通常与盐析 有机溶剂沉淀法联合使用操作时的注意事项 1 由于无机离子的影响 蛋白质的等电点通常会发生 漂移 2 溶质的稳定性 3 盐析效应 4其它沉淀法 选择性变性沉淀法水溶性非离子型聚合物沉淀剂 如PEG成盐类复合物沉淀剂离子型表面活性剂离子型多聚物沉淀剂分离核酸用沉淀剂 4 1选择性变性沉淀法 利用蛋白质 酶 核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异 实现分离 加入变性剂选择性酸碱变性选择性热变性使用时需慎重 热沉淀利用在较高温度下 热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀的现象 分离纯化热稳定性高的目标蛋白的方法 需对目标蛋白和共存杂蛋白的热稳定性有充分了解 4 2水溶性非离子型聚合物沉淀剂 non ionicpolymer dextransandpolyethyleneglycols PEG 聚乙二醇 可能有降低蛋白质分子表面的水化程度或空间排阻作用 Thisworksbecausetheadditionofthepolymerreducestheamountofwateravailabletointeractwiththeprotein 4 3成盐类复合物沉淀剂 此类沉淀剂有以下三种 1 高价金属盐 Cu2 Ag2 Zn2 Ca2 与酸性基团结合 2 苦味酸盐 单宁酸盐 鞣质等 与碱性基团结合 3 无机复合盐 磷钨酸盐 磷钼酸盐等缺点 容易导致活性蛋白的不可逆变性 4 4离子型表面活性剂 十六烷基三甲基季铵盐的溴化物 CTAB 主要用于沉淀酸性多糖 十二烷基磺酸钠 SDS 主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白 4 5离子型多聚物沉淀剂 是一类温和的沉淀剂 与目标蛋白成盐 核酸 多聚阴离子 用于碱性蛋白的沉淀鱼精蛋白 多聚阳离子 用于酸性蛋白的沉淀 2泡沫分离 2 1泡沫分离 foamseparation 根据表面吸附的原理 利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体对液相中的溶质或颗粒进行分离 因此又称泡沫吸附分离或泡沫分级 2泡沫分离 2 2泡沫分离原理根据表面吸附原理 基于溶液中溶质 或颗粒 间表面活性的差异 表面活性强的物质优先吸附于分散相与连续相的界面处 通过鼓泡使溶质选择性的聚集在气 液界面并借助浮力上升至溶液主体上方形成泡沫层 从而分离 浓缩溶质或净化液相主体的过程 2泡沫分离 2 3泡沫分离设备和过程 设备 泡沫柱和消泡器 分离过程可分为 间歇泡沫分离 连续泡沫分离表面活性物质泡沫分离 非表面活性物质泡沫分离浓缩纯化泡沫分离 提取回收泡沫分离 2泡沫分离 2 4影响泡沫分离的因素 料液性质 如pH值 离子强度 其他添加剂等 表面活性剂 操作条件 如进料浓度 气泡尺寸 气体流量 泡沫柱高度 2泡沫分离 2 5应用2 5 1泡沫分离的优势 设备简单 易于放大 操作简便 能耗低 可连续和间歇操作 更适合处理体积庞大的稀料液 分离效率高 2泡沫分离 2 5 2实际应用 细胞的收集或去除 蛋白质 多肽和酶的提取分离 中药有效成分的分离浓缩 3膜分离技术 3 1膜分离的概念 利用膜的选择性 孔径大小 以膜的两侧存在的能量差作为推动力 由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术 用半透膜作为选择障碍层 允许某些组分透过而保留混合物中其它组份 从而达到分离目的的技术 膜的概念与功能 在流体相之间有一层薄的凝聚相物质 把流体相分隔开来成为两部分 这一薄层物质称为膜 被膜分开的流体相物质是液体或气体膜的厚度应在0 5mm以下 否则不能称其为膜 膜在分离过程中的功能 物质的识别与透过 界面 反应场 3 2膜分离技术的类型 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程 近似于筛分过程 依据滤膜孔径大小而达到物质分离的目的 故而可以按分离粒子大小进行分类 3 2膜分离技术的类型 1 微滤 Microfiltration MF 以多孔细小薄膜为过滤介质 压力为推动力 使不溶性物质得以分离的操作 可用于粒子粒径为0 1 m 10 m的过滤 可应用于消毒 澄清 细胞收集等 如培养基液菌体分离与浓缩 产品消毒 3 2膜分离技术的类型 2 超滤 Ultrafiltration UF 分离介质同上 但孔径更小 可分离或浓缩粒子粒径为1nm 50nm的可溶性物质 适合于酶 蛋白质等生物大分子物质的分离 浓缩 超滤亲和纯化 血浆分离 脱盐 去热原 在生物工程中应用最广 3 2膜分离技术的类型 3 反渗透 Reverseosmosis RO 渗透和渗透压 渗透 膜 不能透过溶质 两侧压力相等时 在浓度差作用下 溶剂从溶质浓度低的一侧向溶质浓度高的一侧透过的现象 渗透压 渗透现象中 促使水分子透过的推动力 3 2膜分离技术的类型 反渗透 定义 在溶质浓度高的一侧施加超过渗透压的压力 使溶剂透过膜的操作 是一种以压力差为推动力 从溶液中分离出溶剂的膜分离操作 孔径范围在0 1 1nm之间 3 反渗透 Reverseosmosis RO 3 反渗透 Reverseosmosis RO 其基本原理为溶解扩散 在高于溶液渗透压的压力作用下 只有溶液中的水透过膜 而所有溶液中的大分子 小分子有机物及无机物全被戳留住 主要用于海水脱盐 纯水制造以及小分子产品如乙醇 糖及氨基酸浓缩等 3 2膜分离技术的类型 微滤超滤反渗透 微粒子 大分子 小分子 水 3 2膜分离技术的类型 超滤和反渗透目的 将溶质通过一层具有选择性的薄膜 从溶液中分离出来 分离时的推动力都是压强 由于被分离物质的分子量和直径大小差别及膜孔结构不同 其采用的压强大小不同 反渗透膜的操作压力常达1 10MPa 超滤 需要增加流体的静压力 改变天然过程的方向 才可能发生含有低分子量化合物的溶剂流通过膜 此时的推动力是流体静压力与渗透压的压差 反渗透 过程类似于超滤 只是纯溶剂通过膜 而低分子量的化合物被截留 因此 操作压力比超滤大得多 因此 超滤和反渗透通常又被称之为 强制膜分离过程 3 2膜分离技术的类型 4 透析 用具有一定孔径大小的 高分子溶质不能透过的亲水膜将溶质溶液与纯水分隔 在浓差的作用下 小分子溶质透向水侧 水透向溶液一侧 透析膜 孔径5 10nm 实验室中常用透析袋应用 脱盐 血液透析 特点 以浓差为推动力 膜透过通量很小 不适于大规模生物分离过程 多在实验室中应用 3 2膜分离技术的类型 5 电渗析 以电位差为推动力 利用离子交换膜的选择透过性 从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作 在直流电场的作用下 由于离子交换膜的阻隔作用 实现溶液的淡化和浓缩 分离推动力是静电引力 3 2膜分离技术的类型 电渗析的应用 海水和苦水的淡化 废水处理 氨基酸和有机酸等小分子的分离纯化 3 2膜分离技术的类型 6渗透气化利用膜与被分离有机液体混合物中各组分的亲和力不同而有选择的优先吸附溶液某一组分及各组分在膜中扩散速度不同来达到分离的目的 膜分离技术的类型 生物分离中最常用的膜分离技术是 超滤 微滤和反渗透 3 3膜材料 3 3 1膜材料的特性对于不同种类的膜都有一个基本要求 1 耐压 膜孔径小 要保持高通量就必须施加较高的压力 一般膜操作的压力范围在0 1 0 5MPa 反渗透膜的压力更高 约为1 10MPa 2 耐高温 高通量带来的温度升高和清洗的需要 3 耐酸碱 防止分离过程中 以及清洗过程中的水解 4 化学相容性 保持膜的稳定性 5 生物相容性 防止生物大分子的变性 6 成本低 3 3 2膜的分类 按孔径大小 微滤膜 超滤膜 反渗透膜按膜结构 对称性膜 不对称膜 复合膜按材料分 天然高分子材料 合成高分子材料 无机材料 3 3 3各种膜材料 天然高分子材料 醋酸纤维有机高分子膜 纤维素酯膜 缩合系聚合物 聚砜类 聚烯烃及其共聚物 脂肪族或芳香族聚酰胺类聚合物 全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物 聚碳酸酯 无机多孔膜 陶瓷膜 微孔玻璃等 不同膜材料的特点与应用 3 4膜的结构特性 孔道结构对称膜不对称膜 膜的孔道特性孔径 孔径分布和孔隙率 3 5各种膜组件 由膜 固定膜的支撑体 间隔物及收纳这些部件的容器构成的一个单元 目前市售商品膜组件主要有 管式 中空纤维 螺旋卷绕式 平板式共同的特点尽可能大的膜表面积可靠的支撑装置可引出透过液膜表面浓度差极化达到最小 1管式膜组件 特点 结构简单 适应性强 压力损失少 处理量大 清洗安装方便 可耐受高压 用途较板式广泛 结构 将膜固定在圆管状支撑体上构成管式膜 管式膜并联或串联 收纳在筒状容器内即构成管式膜组件 2平板式膜组件 结构 与板式换热器或加压叶滤机相似 由多枚平板膜间隔重叠加工而成 膜间衬设多孔薄膜 供料液或滤液流动 特点 过滤板相对独立 过滤面积大 结构紧凑 便于清洗 检修和换膜 但耐受压力低 适于超滤单元操作 3螺旋卷式膜组件 结构 将两张平板膜固定在多孔性滤液隔网上 两端密封 膜上下分别衬设一张料液隔网 卷绕在空心管上构成 特点 优点 比表面积大 结构简单 价格较便宜 缺点 处理悬浮物浓度较高的料液时易堵塞 特点是膜堆积密度大 结构紧凑 适合低粘度 渗透产量大 浓缩倍数较低的料液处理和水处理 螺旋卷式膜组件 4中空纤维式膜组件 结构 由数百至数百万根中空纤维膜 内径40 80 m 或毛细管膜 内径0 25 2 5mm 固定在圆筒形容器内构成 优点 比表面积最大 可方便地进行反洗 造价低 工业上普遍使用 缺点 易堵塞 对料液要求高 中空纤维超滤膜成套设备 采用中空纤维膜组件 具有膜堆积密度大 产水量高 操作压力低 价格低廉等特点 适合粘度较低的料液处理和水处理 3 6操作特性 浓度极化模型在膜分离操作中 所有溶质均被透过液传送到膜表面上 不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用 在膜表面附近浓度升高 这种在膜表面浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化或浓差极化 当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时 溶质析出 形成凝胶层 这种现象称为凝胶极化 操作特性 截留分子量 MMCO 截留曲线 测定分子量不同的球形蛋白质或水溶性聚合物的截留率 所得到的膜的截留率与溶质分子量之间关系的曲线 MMCO只是表征膜特性的一个参数 不能作为选择膜的唯一标准 应从多方面 如孔径分布 耐污染能力等 综合考虑 一般将在截留曲线上截留率为0 90的溶质分子量定义为膜的截留分子量 实际膜分离过程中影响截留率的因素 溶质分子量分子特性不同分子截留率大小顺序 球形 带支链 线性 对于荷电膜 与膜相反电荷的分子截留率较低 若膜对溶质有吸附作用 截留率增大 其他高分子溶质的影响其他高分子溶质的存在使溶质截留率增大 操作条件温度升高 膜面流速提高 截留率降低 pH pI时 此时截留率最大 影响膜分离速度的主要因素 1 操作形式终端过滤和错流过滤2 流速3 压力4 料液浓度 1 污染 由于溶质与膜的相互作用而在膜表面和孔内吸附 或因浓差极化 溶质在膜表面产生沉淀或结晶 形成 凝胶层 引起膜性能变化的现象 是一个不可逆过程 通常它受到膜的化学特征 蛋白质种类 溶液的pH值 无机盐浓度 温度等因素的影响 影响 透过通量大幅度下降 降低目标产物的回收率 膜污染是膜技术应用的最大限制因素 3 7膜分离技术应考虑的问题