油菜小孢子培养程序LH整理2017.1.17.docx

一、小孢子培养（microspore culture）1、小孢子培养理论基础小孢子的正常发育途径是形成花粉或成熟的雄配子体，然而，当正常的发育途径遇到障碍时，早期的小孢子将进行有丝分裂而形成愈伤组织，或形成胚状体，最后可发育成孢子体，否则小孢子只有死亡。因此，花药培养和小孢子培养是通过抑制小孢子的正常发育途径，加强交替途径，促使细胞全能性表达的一个过程。培养基的成分，生长素与细胞分裂素的配比，培养条件（温度和光照）以及基因型等，是诱导小孢子改变发育途径的至关重要的因素。2、小孢子培养的目的及用途（1）在基础科学研究领域，小孢子培养已成为研究生理，生化和遗传常用的方法，而且对于实验胚胎学、生理学及分子生物学中基因调控、表达机理的阐明有重要意义；小孢子培养建立的DH（Double Haploid）群体，具有遗传学上的纯合基因组，是AFLP，RAPD，SSR等分子标记和基因图谱的理想材料，可避免二倍体中由于不完全自交，使染色体上DNA碱基的细微差别造成的干扰，大大提高基因定位、标图的准确性。（2）在育种领域，花培育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，是生物技术在农作物育种中应用最广泛、最有成效的方法之一。通过小孢子培养可以缩短材料纯合时间，加快育种进程。3、小孢子培养技术简介 小孢子培养(Microspore Culture)是将植物的小孢子直接从花药中分离出来成为分散的或游离的状态，接种到液体浅层培养基中进行培养，通过培养使小孢子启动脱分化，进而发育成完整植株的一种技术。油菜小孢子培养的优点是：单细胞、单倍性，而且群体数量大、离散性好、发育同步性高、无体细胞干扰、培养快速。 小孢子培养成功的关键在于适宜的供体植株生理状态，还与培养基成分、供体植株基因型、小孢子发育时期、化学物质或高温处理、密度效应、消毒与无菌操作等有关。目前，油菜小孢子培养一般采用NLN培养基，培养基成分包括无机盐（大量元素、铁盐、微量元素）、碳源、氨基酸、维生素等，它们对小孢子培养都有重要作用。一般在初花期从生长健壮的植株上取主花序和上部一次分枝花序。4、小孢子培养方法及操作步骤4.1培养基B5-3、NLN-16、NLN-13、4.2花蕾的选择与预处理 在甘蓝型油菜的初花期，主花序第一朵花开后36d取2.03.5 mm的花蕾，取材的时间为天气晴朗的上午。因为处于此阶段的花粉中单核晚期的小孢子的比例高达70%。具体步骤如下：1）取材。取材时间为天气晴朗的上午10点左右（经验表明此时间段取材利于出胚）。取材的部位：选取主花序的花蕾。该花序有以下特点：A：最好选主枝。主枝的花序对于出胚率很重要（主花序花粉活力强，小孢子的发育时期较一致）。选主枝上花序已开花，且开花朵数在1-10朵之间，开3-5朵花的主花序的花蕾出胚率相对较低，但不同材料之间存在差异。B：在选花蕾时，不要选柱头外露的和花蕾开裂的，避免灭菌不彻底C: 如果没有合适的主花序可取，可以取侧枝的花蕾，但一定要选取离主花序最近的侧枝。D：如果遇到阴雨天气，为了不影响实验进程也可以取材，但一定要选取生长良好的花序，因为有研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生（尽量避免雨天取样）2）选蕾：在实验室选取长度为2.5-3.5mm的花蕾。如果是侧枝，则花蕾的长度要稍大一些，即3.5-4mm（选蕾时可用刻度尺量取长度）。在选蕾时要注意看清楚花蕾是否有被小虫子啃食的现象，如有则丢弃，以防污染。（注释：a 甘蓝型油菜花序一般选取大小在2.5-3.5mm的花蕾，但是不同的油菜品种花蕾发育时期不尽相同，可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定恰当发育时期（最佳时期为单核晚期（单核靠边期）到双核早期；b 取蕾以后如果不能立即进行小孢子的提取过程，应将花蕾放置于湿润条件下低温保存）3）消毒：准备75%酒精和0.1%升汞。一瓶灭菌的空三角瓶，两瓶无菌水，一套抽提工具，B5提取液，N16液体培养基。选取的花蕾用75%的酒精消毒30-45 s（不要超过1 min）。然后用升汞消毒10 min（期间隔几分钟晃动，确保灭菌完全），灭菌完后用无菌水洗3-4次，第一次洗的时间2 min，后几次每次洗3-5 min。在灭菌和无菌水洗的过程中可把镊子进行高温灭菌处理，同时将抽提工具包中的东西取出放置好。4）抽提花粉：A 将灭过菌的花蕾用镊子小心放置于玻璃管中，加入1-2滴管B5培养基后用玻璃棒研磨，使花粉散出。研磨至糊状，用滴管加入半滴管B5，倒入过滤器过滤，花粉滤液进入10 mL离心管B 用滴管吸B5培养基冲洗过滤器中的花粉，冲2-3次后，在10 mL离心管中将花粉悬浮液稀释至10 mL刻度处。C 将花粉悬浮液离心，800转/min，离心5 minD 将离心管的上层清液倒掉，加入少量B5培养基，用滴管将沉淀在管底的花粉吹散，然后定容到10 mL，封口，800转/min，离心5 min，倒去上层清液，准备进行加倍培养。E 将沉淀的花粉用NLN16培养基悬浮，并定容到10 mL，然后转到无菌三角瓶中，置于32条件下暗培养2天左右（48-72h 之间）。F 加倍完后，检查是否用污染现象，如果没有污染，则分皿继续培养G 将加倍后没有污染的NLN16花粉悬浮液用滴管转移到10 mL离心管中，600-800转/min 离心5min，倒掉上清，保留沉淀。H 将沉淀的花粉用NLN13 培养液稀释，稀释后的悬浮液分装于7.5cm的培养皿中，一般每皿加入悬浮液5 mL，每毫升含花蕾大约1.5-2个，用封口膜封口。I 将封口的培养皿于25 条件下进行暗培养。大约10天左右开始查看是否有可见的颗粒状胚形成。若有可见胚形成，等胚长大到一定程度上，置于25、50 rpm/min 摇床上继续暗培养。注：影响小孢子出胚率因素控制设计在小孢子培养过程中作如下处理：（1）花蕾在4条件下处理0、24、48小时；（2）在N16培养液中悬浮培养的时间控制梯度为：48、52、56、60小时，四种处理；（3）在N13培养液中悬浮培养的浓度处理梯度为：1、1.5、2、2.5、3蕾/ml。5后期处理5.1小孢子胚的生长与继代将在暗培养条件下获得的子叶形胚转入B5固体培养基中，培养条件为：24，白/夜为：16 h /8 h，2000Lux光照条件，进行再生苗的诱导。在前几次转胚时，周期要短，大概15天左右换一次培养基，诱导胚状体产生愈伤组织，使其成苗。当胚状体成苗后，可25天左右换一次培养基，操作均在无菌的条件下进行。5.2 组培苗的田间移栽移栽时期主要选择在当室外气温与室内气温接