《凋亡检测实验》PPT课件.ppt

凋亡检测 DNALADDER 主要内容 凋亡概述凋亡检测方法的历史沿革DNALadder实验实验原理实验材料及试剂实验步骤及结果 Apoptosis NecrosisApoptosis KerrandWyllie 1972 Apoptosis Ageneticallyprogrammed non necroticcelldeath Involvedintissuehomeostasis celldifferentiation Playmajorroleinavarietyofdiseases e g Alzheimer AIDS heartfailureandcancer 凋亡与坏死的差别 凋亡坏死 胞体变小变大 胞膜皱缩 形成空泡肿胀 通透性改变 结局形成凋亡小体被邻近细胞吞噬细胞崩解 引起炎症反应 ApoptoticAssay Morphology DNAFragmentation DNALadder CaspaseActivity Anti PARPwesternblot CellMembraneAlteration PhosphotidylserineExposure ApoptoticAssay Morphology DNAFragmentation DNALadder CaspaseActivity Anti PARPWesternblot CellMembraneAlteration PhosphotidylserineExposure endonuclease Gelelectrophoresis Distancebetweencuts mutipleof180bps 180bps ApoptoticDNALadder Lane1 MarkerLane2 negativecontrolLane3 DNAofapoptoticcellsLane4 DNAofnecrosiscells 金标准 实验原理 细胞凋亡过程中 可发生特异性级联生化反应 其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活 此酶可作用于连接DNA的核小体间区域 DNA链被切割成180 200bp或其整倍数的片断 抽提DNA 经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱 固定 将细胞生前结构和化学物质双重地保存下来 需要先固定 方法 1 物理固定 空气干燥 冻结干燥 2 化学固定 如甲醇 乙醇 丙酮 甲醛等 实验步骤 获取凋亡细胞 抽提DNA 琼脂糖凝胶电泳 实验步骤 取16g大小的小白鼠 外科手术取胸腺 少许洗去血迹 放入研磨器中 160目 研磨 边磨边加1640液 获取单个胸腺细胞 将所得混悬液倒入三角烧杯 加入120ml1640液 一般一只小白鼠可获2x106 ml细胞 每孔加入1 2mlDEX 5mg ml 混匀 co2培养箱 370c 5h 取1ml混悬液 加入24孔培养板中 将每孔细胞悬液转移至新的Ep管中 3000rpm 5min 去上清 加入70 乙醇700ml混匀 震荡打散细胞 200c固定过夜 离心 3000rpm 5min 去上清 不要回倒 棉棒沾干液体 勿触及沉淀 将上清转入1 5mlEP管 离心12000rpm3min 加400ul裂解液 加100ul蛋白酶k 混匀 600c水浴 30 45min 100ul饱和Nacl 充分震荡 离心12000rpm3min 将上清转入无水乙醇管 颠倒离心管数次可见白色絮状物 DNA 离心12 000rpm 1min 弃上清 并用棉签吸干残留的无水乙醇 析出的DNA应成小白点状沉淀于管底 如贴附于管壁 加溶解液时应小心 取凝胶到凝胶成像仪上拍照分析 加入20ul溶解液至管中 反复吸打数次至DNA溶解 电泳80v 1h 吸出20ul已溶解的凋亡细胞DNA 加入到2 琼脂糖凝胶孔电泳 1 取出胸腺后 一定要注意将组织去除干净 2 样本须先经70 乙醇固定 以防止DNA降解 3 70 乙醇 无水乙醇应 200c预冷 4 氯仿抽提蛋白时 应