医学免疫学-免疫学检测技术

免疫学检测技术,Immunodiagnosis,第一节 抗原或抗体检测,I. Detection of antigens or antibodies,一、抗原-抗体反应的特点,Specificity（一）高度特异性 Cross-reaction: common antigen 交叉反应：共同抗原 Antiserum absorption 抗血清吸收 1st antibody & 2nd antibody 一抗；二抗,Reversibility/invertibility:,（二）可逆性 non-covalent, surface-binding , dissociable 非共价、表面结合，可解离 complementary capacity: affinity; avidity 互补程度：亲和力 ； 亲合力,Visibility,（三）可见性的条件Compatible concentrations of antigen and antibody combined in proportion at or near equivalence Antigen: multivalent; Antibody(IgG): divalent 比例适合：抗原多价，抗体2价。交织成网。Ph value; Temperature; Ionic concentration 条件适宜：酸碱度、温度、离子浓度Adequate concentration, binding strength; reaction time 足够浓度、结合强度和反应时间,Prozone phenomenon前带现象,二、抗原-抗体反应的应用,Terms 术语Serological reaction 血清学反应Qualitative analysis 定性Quantitation 定量Orientation 定位Titration 滴定Titer 效价/滴度,三、常用的抗原-抗体反应技术,经典技术中和反应补体结合反应凝集反应沉淀反应,I ) Agglutination,（一）凝集反应：颗粒性抗原或包被有可溶性抗原的颗粒 + 相应抗体肉眼可见的凝集块 1. 直接凝集 颗粒性抗原+ 相应抗体 玻片凝集：抗原定性 （ABO血型） 试管凝集：抗体定量 （肥达反应） 2. 间接凝集 包被有可溶性抗原的颗粒 + 相应抗体 红细胞（间接血凝）；乳胶（间接乳凝） Coombs Test: 红细胞（Rh抗原）+ 不完全抗体 + 抗人球蛋白 3. 派生的试验 反向间接凝集反应：包被抗体的颗粒 + 抗原 间接凝集抑制反应： （乳胶妊娠试验） 抗体 + 未知抗原 + 包被有相应可溶性抗原的颗粒 凝集？,Haemagglutination,II ) Precipitation （二）沉淀反应,可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质琼脂扩散/免疫扩散1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）4. 对流电泳： 双向免疫扩散 + 电泳 （抗原/抗体定性）5. 火箭电泳： 单向免疫扩散 + 电泳 （抗原定量）免疫比浊： 抗体 + 递增量抗原比浊（抗原定量）,III ) Immunolabelling Techniques （三）免疫标记技术,标记物： 荧光素、酶、放射性核素、电子致密物质、化学发光物质标记对象：抗原或抗体用途： 定性、定量、定位免疫荧光法（IFA ） 荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位 （1）直接荧光法 （2）间接荧光法： 荧光素一抗 荧光素二抗 对每种抗体作标记 不必标记每种抗体 特异 敏感 测Ag 测Ag/Ab,免疫荧光法,2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化,（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原（2）间接法ELISA： 查抗体（3）BAS-ELISA ： Biotin-Avidin-酶放大系统（4）ELISPOT测定法： _包被物 待测物 测定结果_ 抗CK抗体 CK分泌细胞 单一CK 已知抗原 B细胞 特异B细胞 （5）酶免疫组化* 酶标抗体 + 组织/细胞（未知抗原） + 形态学检查,*免疫组化技术：可对抗原定性、定量、定位 酶免疫组化： HRP免疫金银组化： 胶体金颗粒免疫电镜技术： HRP、胶体金、铁蛋白,双抗体夹心法、间接法ELISA,间接法ELISA,ELISA操作图,可调移液器,8孔道可调移液器,3. 放射免疫测定（RIA）,常用 125I，测定微量物质4. 化学发光免疫分析 常用 鲁米诺，测定超微量物质5. 免疫印迹法（Western Blotting） 先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定,第二节 免疫细胞的测定,一、淋巴细胞的分离与类型鉴定 （一）血细胞分离 外周血 密度梯度离心法 外周血单个核细胞（淋巴细胞+单核细胞） 吸附培养分离法 淋巴细胞 尼龙毛，抗CD3单抗，E花结 T细胞 B细胞,（二）淋巴细胞鉴定,免疫荧光法 常用间接法测CD3/CD4/CD8、mIgM/mIgD2. 磁珠分离法 如抗CD4抗体交联微珠可分离CD4与CD83. 流式细胞术（Flow Cytometry, FCM） 可分析细胞大小、核型、表面分子（多种荧光标记） 检测各类免疫细胞及其比率 白血病、淋巴瘤的免疫学分型 细胞分选,二、淋巴细胞功能测定,（一）T细胞功能测定 1. T细胞增殖试验： 丝裂原/抗CD3刺激/特异抗原细胞增殖 （1）同位素掺入法 （2）MTT法 （3）形态观测法 2. 细胞毒试验 CTL、NK细胞杀伤靶细胞 （1）51Cr 释放法 （2）凋亡细胞检查法 阶梯状酶切图谱 TUNEL法 FCM,3. 细胞因子检测,（1）免疫学检测法 夹心法ELISA FCM（2）生物学检测法 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验 （3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力,（二）B细胞功能测定,B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM2. 抗体形成细胞检测 溶血空斑试验 ELISPOT试验,（三）吞噬细胞功能的测定,趋化功能测定 Boyden 小室2. 吞噬功能测定,第三节 补体及循环免疫复合物的测定,III. Application of immunological techniques第四节 免疫学检测方法的应用,1. Assessment and selection 一、免疫学检测方法的评估与选择 Reliability: true vs false 可靠性 ( gold standard*=真阴性率与真阳性率) * Specificity= 真阴性/（真阴性+假阳性）x 100% * Sensitivity= 真阳性/（真阳性+假阴性）x 100% Safety 安全性 Simplicity 简易性 Saving of time and money 经济性,Selection as per requirement and availability 依据需要与可能选择,Screening: 初筛 high sensitivity first, to avoid case missing 避免漏诊Diagnosis: 确诊 high specificity first, to avoid misdiagnosis 避免误诊,2. Clinical application 二、免疫学检测方法的临床应用,1) Infectious diseases （一） 感染性疾病 pathogen 病原体的特异抗原或抗体检测2) Immunodeficiency