研究生课程药物基因-3

药物代谢基因与耐药基因的检测,天津医科大学 魏殿军,Drug Metabolism,药物代谢 drug metabolism,生物转化 biotransformation药物代谢结局 1.灭活（inactivation） 2.活性降低 3.活化 4.形成毒性代谢物 5.激活：前药,药物的代谢部位,1.组织器官：肝脏（肝微粒体） 胃肠道（消化道上皮细胞；肠道菌群） 血浆、皮肤、肺、肾、脑 2.亚细胞： 内质网、线粒体、细胞浆,药物代谢的类型,一相反应：氧化：还原：水解： 一相反应产物多数丢失活性，但也是产生活性或毒性代谢物的主要途径。（微粒体酶系）,两相反应,二相反应： 结合：极性增 大，水溶性增 加，易于排泄，活性消失。（细胞浆内）,影响生物转化的因素,Factors Influencing Drug Effects,Height/ Weight,Gender,Age, ElderChildrenNeonate,Genetic polymorphism,Food/Smoking/DDI,Disease progress,Organ function,Complication,Individual variation of drug effect,个体化,药物毒性或不良反应的发生往往是因为药物反应的个体差异所致个体差异使药品的效果差异显著What Is Individualized Medicine?,21 世纪的经济将有赖于美国的科学技术和研究开发。我们曾消灭了小儿麻痹症，并初步解读了人类基因组。我希望，我们的国家能引领医学的新时代这一时代将在合适的时间给疾病以合适的治疗。对那些患有囊泡纤维化的病人，我们能将他们转危为安，这个病在过去是不可逆转的。今天晚上，我要启动一个新的“精准医学计划（Precision Medicine Initiative）”。这一计划将使我们向着治愈诸如癌症和糖尿病这些顽症的目标迈进一步，并使我们所有人，都能获得自己的个体化信息。我们需要这些信息，使我们自己，我们的家人更加健康。 奥巴马 2015 年 1 月 20 日,医学模式的变迁,经验医学Trail and Error medicine,循证医学Evidence-Based medicine,精准医学Precision medicine个体化医学Personal medicine,经验医学,根据非实验性的临床资料、经验和对疾病基础知识的理解来诊治病人反复尝试、不断探索、试错个体化经验,询证医学,意为遵循证据的医学，又称实证医学，港台地区也译为证据医学。其核心思想是医疗决策（即病人的处理，治疗指南和医疗政策的制定等）应在现有的最好的临床研究依据基础上作出，同时也重视结合个人的临床经验。,循证医学中证据的质量分级,证据是循证医学的基石，遵循证据是循证医学的本质所在。临床研究者和应用者应尽可能提供和应用当前最可靠的临床研究证据是循证医学的关键。循证医学中的证据：主要指临床人体研究的证据，包括病因、诊断、预防、治疗、康复和预后等方面的研究。治疗研究依据按质量和可靠程度大体可分为以下五级（可靠性依次降低）：一级：按照特定病种的特定疗法收集所有质量可靠的随机对照试验后所作的系统评价或Meta分析。二级：单个的样本量足够的随机对照试验结果。三级：设有对照组但未用随机方法分组的研究。四级：无对照的系列病例观察，其可靠性较上述两种降低。五级：专家意见。在没有这些金标准的情况下，可依此使用其他级别的证据作为参考依据但应明确其可靠性依此降低，当以后出现更高级别的证据时就应尽快使用。,郭艺芳：关于循证医学的是是非非,我于1987年参加工作，那是一个经验医学模式占据绝对统治地位的时期。例如，流行病学研究发现，心肌梗死后患者若存在室性心律失常，患者死亡率会显著增高，于是在临床上只要见到室性早搏我们都会不惜一切手段全力剿杀。当时我们深信这样做会给患者带来好处，会提高生存率。 然而，1989年发表的CAST试验（心律失常抑制试验）却令我们大跌眼镜！该研究发现，心梗后患者应用英卡胺、氟卡胺等王牌抗心律失常药物治疗，虽然可以显著减少室性心律失常数量，但患者死亡率却增高数倍。我们诧异，我们不解，但事实就是如此，你不能不相信！该试验的布，对心律失常的药物治疗策略产生了深远的影响。,郭艺芳：关于循证医学的是是非非,循证医学带给我们的不只是剌激，更多的是对疾病诊疗策略的发展与完善。数十项大型RCT使得他汀在各类降脂药物中脱颖而出，也使得百年老药阿司匹林枯木逄春、再度辉煌。如今这两类药物已成为治疗缺血性心血管病不可或缺的组分。现今我们关于什么情况下应该使用降压药物、应该降低到什么水平、应该选用什么药物的认识同样来自于上百项RCT研究结论。在冠状动脉介入治疗日趋普及的今天，那些患者应该接受介入治疗、哪些应该进行药物治疗，RCT同样给予了我们清晰的回答。正是由于循证医学体系的建立与推广，让我们推翻了无数荒谬、获取了更多新知，让更多的患者得到了正确合理的治疗。,郭艺芳：关于循证医学的是是非非,循证医学绝对是一个好东西！？不，问题或许并非如此简单！循证医学只是一种工具。利用这一工具既可以做好事，也可以做不好的事情，关键看我们如何去使用它。我可以虚构一个例子：为探讨新药A对冠心病患者预后的影响，我进行了3项RCT，其中一项研究显示A药可改善患者预后，而另两项研究却显示该药对患者预后无益甚至有害。倘若将这三项研究结论完全公布于众，大家将会认为A药的作用尚有争议，仍需更多研究论证。但是，倘若我仅将结果阳性的一项研究公布，而另两项研究不予发表，那么大家肯定会认为A药对于改善患者预后很有帮助。实际上，即便我将三项研究全部发表，也未必保证大家会对此问题有客观全面的认识，因为只有少数人去阅读这些文献，更多的医生只是通过各种学术讲座来获取相关知识。三篇文献发表后，若我利用各种机会大肆宣讲那项阳性研究结果，而对另外两项研究只字不提，同样会误导广大临床医生。 我撒谎了吗？我没有，我说的都是实话，只不过我以及我的朋友们只讲了对我有利的话,循证医学的问题,BMJ刊登了一篇文章，指出当前过度诊疗之风愈演愈烈、询证医学难辞其咎。各大药企与询证医学结盟，如今询证医学像一般已经上膛的枪，瞄准医生的脑袋威胁说：“你最好乖乖的按照最佳证据去做”，不留一点自我辨析、判断的空间。,精准医学概述,以个体化医疗为基础，随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念，本质上是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术，对于大样本人群与特定疾病类型进行生物标志物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确寻找到疾病产生原因和治疗的靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确亚分类，最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精确治疗的目的，提高疾病预防与诊治的效益,美国国立卫生研究院( NIH) 院长Francis Collins， 在新英格兰医学杂志就“精准医学计划”发表评述文章指出，精准医学并不是一个全新的概念，实质就是“个性化医疗”。简言之，精准医学就是要根据每名患者的个人特征，量体裁衣式地制定个性化治疗方案例：100年前开展的根据患者血型制定不同输血方案的做法就是精准医学最早的实施案例,精准医学的意义,现代精准医学是通过生物样本库得出完整的临床信息，结合分子影象，大数据分析，形成个性化的治疗方案，并贯穿于诊疗的全过程，从而优化诊疗，精准治疗，最终实现增加疗效，解决治疗不足、治疗过度，减轻治疗的损伤，降低费用的目的,What Is Individualized Medicine?,21,研究背景,药物治疗的个体差异现象无法用传统药动学和药效学解释,Recent Developments of Human Genome Projict,美国时代封面特别报告 揭开DNA的秘密 50周年纪念演讲 1953年，瓦特森和克里克在自然杂志上发表了题为分子结构：一种可能的结构 基因科学已怎样改变了我们 的生活？ 高瞻远瞩展未来,美国新闻周刊封面标题 基因组学 人类机体解码竞技,Who we are?How we evolved?AndWhat can we do in disease diagnosis and drug therapy?,什么是基因组(Genome)?,核酸核糖体,细胞,碱基对,人类基因组的含义,遗传信息和遗传物质。要揭开生命的奥秘，就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。,人类基因组计划,人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。我国承担其中1%的任务，即人类3号染色体上约3000万个碱基对的测序任务。按照这个计划的设想，在2005年，要把人体内约10万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图，揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。,Collins et al., Nature 4/24/03,人类基因组计划十四年大事记,30,Collins et al., Nature 4/24/03,人类基因组计划十四年大事记,基因测序技术的发展,技术进步（1）成本急剧降低（2）测序速度大幅提升,Recent Developments of Pharmacogenetics and Pharmcogenomics,什么是DNA变异？,人类基因组中，99.9%的编码序列（核苷酸序列）是一致的人类显著的多样性，其实在基因水平上不到0.1%的DNA发生变异人类最常见的DNA变异为SNP，目标种群的SNP发生率超过1%时，就称为变异或多态性在基因组DNA中，平均每1250个碱基对中就有一个SNP，出现在外显子导致氨基酸改变，出现在内含子或基因间区域或将改变基因的转录与蛋白表达活性不到1%的SNP可以直接改变一个基因的最终蛋白产物,35,什么是基因多态性?,人类最常见的基因变异形式是基因多态性（Genetic Polymorphisms）, 表现为单核苷酸多态性(Single Nucleotide Genetic Polymorphisms, SNPs);SNPs包括单个碱基的缺失和插入, 单个碱基的置换以及整个基因的删除等;人类是一个具有多态性的群体,某种变异发生在1%人群时,即为基因多态性,30个基因突变位点，*28在个人群中分布广UGT1A6突变降低对丙戊酸代谢,药物转运蛋白MDR1(多药耐药基因)调控许多药物吸收、分布和排泄过程与胆红素、抗癌化疗药物、强心苷、免疫抑制剂、糖皮质激素、HIV型蛋白抑制剂有关药物靶蛋白ADRB2编码人2肾上腺受体人类白血球抗原HLA-BHLA-B变异，将引起某些药物的严重皮肤反应,西妥昔单抗,单位点、单因素、定性方案,基因拷贝数增高,治疗获益明显,多位点、单因素、定量方案,癫痫患儿,681GA-636GG-1075AC正常剂量的74,681AA-636GG-1075AA正常剂量的90,其他基因型患者正常剂量,6岁标准剂量的1007474,612岁标准剂量的927468,12岁标准剂量的787458,6岁标准剂量的1009090,612岁标准剂量的929083,12岁标准剂量的789070,6岁标准剂量,612岁标准剂量的92,12岁标准剂量的78,正常剂量：药品在野生型中的正常用量，25.0mgkg-1标准剂量：药品在6岁以下野生型儿童中的用量，25.8mgkg-1,高血脂药物及硝酸甘油,遗传性耳聋约70%的耳聋为遗传性耳聋。GJB2是导致遗传性耳聋最常见的基因，在我国约有21%的先天性耳聋患者与该基因相关；其次为PDS基因（即大前庭导水管，在我国接近20%）和线粒体DNAA1555G突变（1%2%）。携带隐性遗传耳聋基因的父母，再生育聋儿的风险25%，显性遗传耳聋再生育则具有50%的风险。,基因多态性与耳聋,全国聋病分子流行病学调查,系统的阐明和揭示了常见耳聋基因的致病机制、特异突变频谱及发病规律。明确提出了中国耳聋人群中遗传因素致聋比例为55%，一线致病基因（GJB2、SLC26A4及线粒体12SrRNA）比例为33.8%为耳聋基因诊断以及产前诊断的开展提供了理论依据,58,先天性耳聋基因GJB2,临床表现,先天性耳聋,遗传方式,携带比率,常染色体隐性遗传,21%的聋人2%3%的正常人群,59,GJB2基因突变检测的意义,明确耳聋的分子学病因，终止大范围盲目的病因学检查配合新生儿的听力筛查手段，及早明确GJB2基因突变的耳聋诊断，进行早期听力康复提示良好的电子耳蜗移植的预后疗效适合于产前筛查和诊断,60,“一巴掌打聋基因”SLC26A4,61,临床表现,先天性耳聋迟发性耳聋,遗传方式,携带比率,常染色体隐性遗传,14.5%的聋人约2%正常人群携带,61,SLC26A4基因与大前庭导水管综合征关系,SLC26A4基因突变与散发性大前庭水管综合征及内耳畸形联系密切CT显示前庭水管扩大，可合并耳蜗和（或）半规管畸形临床表现：多在学龄前发病，呈进行性或波动性听力下降多为重度以上感音神经性聋，轻度的头部外伤可诱发及加重耳聋遵循常染色体隐性遗传模式，多表现为散发,62,SLC26A4基因突变检测的意义,配合或代替影像学检查（颞骨CT）明确耳聋遗传基因指导患儿的日常行为及注意事项提示良好的电子耳蜗移植的预后疗效适合于产前筛查和诊断,63,大前庭水管综合证患者生活指导,严格防止头部外伤，禁止参加剧烈体育活动，防止头部侧立，尽量防止感冒，不要用力擦鼻或咳嗽，勿用耳毒性药物，远离噪声，如果在原有基础上听力再次发生下降，应及时到医院就诊，按突发性耳聋治疗，应用血管扩张剂、神经营养剂，必要时使用类固醇激素,64,“一针致聋”基因12SrRNA,临床表现,药物敏感性耳聋,遗传方式,携带比率,线粒体基因母系遗传,4.4%的聋人0.3%正常人群,65,12SrRNA基因突变的筛查意义,阐明耳聋病因，提示耳毒性药物导致耳聋对其他未发病母系成员具有预防作用（1:10）通过新生儿筛查预防散发性耳毒性药物致聋,66,药物性耳聋可以主动预防,所有被诊断为药物性耳聋基因突变的携带者，都将终身禁用上面所列所有的氨基糖苷类药物，避免“一针致聋”的发生,67,葡萄糖6-磷酸脱氢酶,遗传变异可使抗疟药引发溶血反应（蚕豆病）,2017/11/21,68,本世纪，肿瘤的药物治疗取得了巨大成就。但肿瘤细胞的多药耐药性和肿瘤药物治疗的个体差异常造成肿瘤化疗的失败，且引起严重的毒副反应。个体药物治疗的药效和毒性的差异在很大程度上受到遗传因素如药物代谢酶、药物转运蛋白和药物作用靶点等药物相关基因的遗传多态性的影响。所以抗恶性肿瘤药临床有效率为30-80 %,肿瘤个体化治疗与基因检测,根据病人的遗传特征,选择最有效的疾病治疗方法，更好地控制疾病的进展甚至预防疾病的发生，实现最佳的医学治疗效果。 在合适的时间(Right Time)给合适的病人(Right Patient)施行合适的治疗(Right Treatment),达到肿瘤个体化治疗,肿瘤个体化治疗与基因检测,耐药谱： 原药耐药（primary drug resistance，PDR）：只对诱 导的原药产生耐药，而对其它药物不产生产交叉耐药 多药耐药（multi drug resistance，MDR）：是由一种 药物诱发，但同时又对其它多种结构和作用机制迥异 的抗癌药物产生交叉耐药,概 述,肿瘤耐药性：肿瘤细胞对化疗药物的不敏感性 多药耐药性（multi drug resistance ，MDR） 肿瘤细胞对一种化疗药产生耐药现象后对非同类结 构、细胞靶点和作用机制迥然不同的其他化疗药物 产生交叉耐药。 耐 药 性： 先天性耐药（natural resistance） 获得性耐药（acquired resistance）,肿瘤细胞多药耐药性作用机制,主要有以下几个方面 发生在细胞膜水平的药物摄取减少和外排增多，引起细胞内药物的绝对浓度降低，（如：MDR1基因编码的pglycoprotein， P-gp引起的耐药性） 发生在细胞质和细胞器水平的药物亚细胞分布的改变，使药物无法接近其作用靶点，引起药物有效浓度降低，如由多药耐药性相关蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）引起的耐药性 肺耐药性相关蛋白（Lung resistance related protein，LRP）和乳腺癌耐药性蛋白（breast cancer resistance protein，BRCP）对化疗药物的胞吐作用,肿瘤细胞多药耐药性作用机制, 细胞解毒系统和修复系统功能加强,使药物迅速灭活，药物引起的肿瘤细胞DNA 损伤得以及时修复,如与GST有关的耐药性 药物靶点在质和量上的改变，主要指拓扑异构酶（TOP ）表达降低，并发生点突变，活性降低，减弱了以TOP 为靶点的药物的细胞毒性 PKC活性升高，促进P-gp及拓扑异构酶的磷酸化 抗凋亡基因Bcl- 2表达增高及凋亡基因Fas、Bax的降低等,p53基因与肺癌耐药,是迄今为止发现与人类肿瘤密切相关的基因之一参与细胞周期的调控与肺癌等恶性肿瘤的耐药性相关 依立替康和CDDP与野生型p53基因转染联合治疗对NSCLC逆转有效,拓扑异构酶（Topo）与肺癌耐药,DNA Topo是一种能催化DNA超螺旋结构局部构型改变的核酶，有Topo 和Topo Topo 介导的MDR是以细胞内药物聚积障碍和对所有抗Topo 药物交叉耐药为特征以Topo 为作用靶点的药物：蒽环类药物、喜树碱、鬼臼毒类药物等,肿瘤耐药机制,.,Text in here,Text in here,细胞表面药泵蛋白外排,DNA修复异常,临床上对于肿瘤MDR及其预防与逆转的研究主要集中在药物转运泵上，药物转运泵即耐药蛋白,凋亡通路阻滞,药物作用靶点改变,药物作用靶点改变,DNA复制转录细胞分裂,药物-酶-DNA复合物减少，药物失去效靶,肿瘤药物重要作用靶点,Topo,酶转录水平活性降低，酶学特征改变,肿瘤个体化治疗包括靶向治疗和化疗两部分:靶向治疗:通过实时定量、基因测序、FISH等技术检测肿瘤患者基因拷贝及基因突变信息，根据检测结果进行靶向治疗。个体化化疗：通过实时定量、基因分型、mRNA定量等技术，检测患者肿瘤标本或血液标本的mRNA表达、DNA的SNP分型，确定患者对化疗药物的敏感性和毒性反应并确定化疗剂量。,肿瘤个体化治疗与基因检测,肿瘤治疗的分子靶向药物主要有两类:一类作用于肿瘤细胞内的小分子TKIs （EGFR酪氨酸激酶抑制剂）,包括吉非替尼、厄洛替尼、伊马替尼和拉帕替尼等;另外一类是作用于细胞外的单克隆抗体,主要是西妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗和帕尼单抗等它们都作用于肿瘤细胞的EGFR信号传导通道,影响肿瘤增殖、转移和血管生成。,肿瘤的分子靶向治疗,抗EGFR单抗作用机制,西妥昔单抗与EGFR具有较强的亲合力，可结合EGFR抑制下游信号传导从而干扰肿瘤生长、侵袭和转移以及细胞修复和血管生成。,肿瘤的分子靶向治疗,EGFR、西妥昔单抗与K-ras基因突变,随着西妥昔单抗的推广应用，发现在结直肠癌中靶向EGFR治疗的效果与K-ras基因状态密切相关，即抗EGFR治疗仅对K-ras基因野生型有效，而对突变型无效。K-ras基因功能正常时(野生型)，抗EGFR单抗与EGFR结合，抑制EGFR二聚体，阻断信号通路，阻断肿瘤生长；K-ras基因突变后可旁路激活细胞内信号传导，导致抗EGFR单抗丧失抗癌活性，即治疗失败。,肿瘤的分子靶向治疗,靶向药物及检测基因,肿瘤细胞基因表达与化疗药物,突变基因与化疗药物,抗真菌药物的作用机制及耐药性,第一个发现并被用于临床的为上世纪30年代末，从微生物发酵代谢产物中分离得到的灰黄霉素；1944年报道了唑类化合物的抗真菌作用；1949年从微生物代谢产物中分离得到了制霉菌素；1956年报道了两性霉素B的抗真菌活性；1958年灰黄霉素被用于临床；同年，上市了第一个唑类抗真菌药物；1960年两性霉素B被用于临床；1962年报道了氟胞嘧啶（flucytosine）的抗真菌活性；1969年咪康唑和克霉唑（clotrimazole，局部）被用于临床；1974年依康唑被用于临床；1978年描述了阿莫罗芬（amorolfine）；1979年咪康唑parenreral制剂在英国上市；,1981年酮康唑口服制剂在美国得到批准上市；同年第一个烯丙胺类药物萘替芬（naftifine）进入临床试验；1987年开始研究开发多烯类药物的脂质体制剂；1988年开始试验第一个棘白菌素类（echinocandins）药物；19901992年氟康唑和依曲康唑开始在美国使用；19931995年报道了第二代三唑类抗真菌药物；19951996年通过了第二个烯丙胺类药物特比萘芬（terbinafine），以及通过了两性霉素B脂质体制剂；1997年通过了依曲康唑口服溶液制剂；2001年上市了第一个棘白菌素类药物caspofungin；2002年上市了第二个棘白菌素类药物magfungin。,真菌作用机制,与细菌耐药性的研究比较，对真菌耐药性的研究还是非常有限抗真菌药物的作用靶位是抑制真菌细胞膜重要组分麦角甾醇的合成或抑制其功能的发挥。 大多数抗细菌药物的作用靶位是抑制细菌细胞壁重要组分肽聚糖的合成,真菌药抗物的作用机制,抗真菌药物的作用靶位集中在细胞表面：干扰细胞膜的合成如唑类药物氟糠唑等和多烯大环内酯类如两性霉素B等；干扰细胞壁中几丁质的合成如日光霉素和多氧霉素等；干扰细胞壁中1,3-葡聚糖的合成如卡帕芬净等；干扰细胞表面甘露糖蛋白复合物的合成如pradimicin等 .,1：靶酶过量产生；2：药物结构被改变；3：药物被外排蛋白泵出；4：药物在细胞壁水平/细胞膜水平被阻止；5：细胞由于药物的作用而产生的补偿途径以使细胞保持活性；6：某些能够将钝化的药物转化为活性药物的酶被抑制；7：细胞产生某些能够降解药物的酶并分泌至胞外。,真菌对唑类抗菌药物产生耐药性的生物化学机制,A：由两性霉素B在细胞膜上产生的孔道；B: 两性霉素B与细胞膜上的胆甾醇以氢键的形式结合，从而破坏细胞膜的结构产生孔道,两性霉素B的应用,两性霉素B适用于治疗大多数深部真菌病,如隐球菌、假丝菌、曲霉菌、毛霉菌、球孢子菌、膜组织胞浆菌和芽生菌等引起的各种脏器和全身感染；也可用于治疗皮肤和粘膜真菌病,以及使用广谱抗生素时预防并发真菌病。两性霉素B可作为全身或深部真菌感染的首选药物,如隐球菌脑膜炎、真菌性菌血症、真菌性心内膜炎、肺部真菌感染、真菌性肠炎、真菌性角膜溃病及阴道炎等。,乙型肝炎检测标志物：HBsAg，抗-HBs,HBeAg，抗-Hbe,抗HBc (IgG,IgM),HBV-DNA,Dane颗粒（完整的病毒）形态,乙型肝炎的分子诊断,乙型肝炎的分子诊断,1. 重要性全球 20亿人感染慢性 3.5亿人中国、东南亚、非洲50肝硬化，70-90肝癌7-30携带者感染变异体,感染HBV之后,乙肝病毒只对肝脏“情有独衷”,急性乙肝,6个月,HBV被清除产生保护性抗体机体知道如何保护我们不再感染HBV,慢乙肝,6个月,如果6个月后仍然没有清除HBV，就成为慢乙肝意味着：HBV一直停留在肝脏和血液中,有相当部分的患者转为慢性乙肝,成为慢乙肝之后,小结,抗病毒才 “治本”，切莫偏听偏信乱服“保肝 ”“降酶药”，只有抗病毒才能真正保肝。乙肝病毒很难从体内彻底清除，需要长期治疗,什么时候开始抗病毒治疗?,如果你的HBeAg呈阳性,中国慢性乙肝防治指南2005,耐药：阻止核苷类药物达成治疗目的的重要原因,+,理想的抗病毒药物,什么是乙肝病毒耐药？,乙肝病毒耐药 是由于乙肝在抗病毒治疗过程中乙肝病毒(HBV)的结构发生了改变，原本对它有效的药物失去了作用，从而导致药物的治疗效果下降，疾病反弹。,原本有效的药物对发生耐药变异后的病毒束手无策,变异前，药物有效抑制病毒,变异后，药物对病毒束手无策,耐药的危害：病情恶化，阻碍治疗目标的实现,耐药发生后，原本有效的药物对病毒的抑制作用消失HBV DNA水平再次升高，病毒复制卷土重来肝脏损伤加重，ALT水平再次升高发展为肝硬化、肝癌等严重并发症的风险大大增加肝移植失败风险加大,耐 药,慢乙肝抗病毒治疗,初始治疗时对耐药问题缺乏重视使原本可以顺利的病情控制过程平添暗礁,影响耐药发生的因素：病毒发生耐药变异需要突破的药物基因屏障,抗病毒药物的基因屏障就是阻止耐药病毒株出现的防御工事基因屏障高的药物，耐药发生率低,只有1道基因屏障拉米夫定,有3道基因屏障恩替卡韦,如何应对耐药问题呢?,2. HBV基因型与血清型关系及流行病学分布基因型与血清型不完全一致临床突变率不同有地域分布特点,乙型肝炎的分子诊断,表1：,表1(续）:,3. 基因型与临床实验室表现不同（表2）病情与转归：C较B差抗病毒治疗：A优于D B优于C adw/ayw 20:1,乙型肝炎的分子诊断,表2:,4. 一般实验室分型方法测序PCR-RELP（限制性片断长度多态性）PCR核酸杂交（谱线探针法）血清学：单抗可区分A-F各基因型,乙型肝炎的分子诊断,5. 抗病毒治疗的耐药性问题拉米夫定耐药性的检测,乙型肝炎的分子诊断,耐药分析,耐药基序 （Drug resistance motifs）HBV表型耐药（Phenotypic resistance）临床耐药 （Clinical resistance）三者相关，但不完全等同,HBV polymerase,(wild-type),Lamivudine and wild-type HBV(一),Nucleotides,ss (-) DNA,high,affinity,Y,M,D,D,Lamivudine and wild-type HBV(二),HBV polymerase,(wild-type),Nucleotides,high,affinity,Lamivudine,inhibition,ss (-) DNA,Y,M,D,D,Lamivudine and YMDD variant HBV,Y,V/I,D,D,Nucleotides,reducedaffinity,Lamivudine,weak inhibition,ss (-) DNA,HBV polymerase,(variant),拉米夫定耐药性的检测耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸变异有关I型：YMDD变异为HBV聚合酶基因(P区基因)区第741个核苷酸位,A-G置换，使第552个密码子蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)取代，成为YVDD变异II型：YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G-T置换，使第55个密码子蛋氨酸(M)被异亮氨酸(工)取代，成为YIDD变异 YMDD变异：Y（酪氨酸） M（蛋氨酸） V（缬）： YVDD变异 D（天冬氨酸） I（异亮）：YIDD变异 D（天冬氨酸） 最近报道： YSDD （ATG AGT ） 应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点,乙型肝炎的分子诊断,乙型肝炎的分子诊断,细菌耐药性的起源,我们战胜了细菌！,恩格斯说：“我们不要过分陶醉于人类对自然界的胜利。对于每一次这样的胜利，自然界都报复了我们”。,青霉素耐药菌的出现,1942年青霉素应用临床：1951年出现产青霉素酶金黄色葡萄球菌1960年甲氧西林应用临床：1961年出现耐药菌，即MRSA，对所有-内酰胺抗生素无效,细菌耐药性是如何产生的？,首先，细菌耐药性是细菌之间为了生存相互抗争的结果，是一种自然现象。,细菌在抗生素选择性压力下，保留了它们中最耐药的菌株。这些耐药菌不仅可以在细菌间传播耐药性，也可在人与人之间，地区间乃至全球范围播散 。,与细菌较量，人类输了第二局,病原菌的变迁,Gram Positive ResistanceICU 1995-2004,National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System,Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,Vancomycin-Resistant Enterococcus,Gram Negative ResistanceICU 1995-2004,National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System,3rd Generation Cephalosporin-Resistant Klebsiella pneumoniae,Fluoroquinolone-Resistant Pseudomonas aeruginosa,Tip of the Iceberg?,Percent of Cases Identified,760 Cases of VRE identified between Jan 1997 Oct 1999,Clin Infect Dis 2003;37:326-32,86% undetected by clinical specimen alone,Susceptible Bacteria,Emergence of Antimicrobial Resistance,Selection for Antimicrobial-Resistant Strains,Mechanisms of antibiotic resistance,Efflux PumpsHydrolysisReduced UptakeSequesteringEnzymatic Modification,The Science Creative Quarterly 2: Jan-March 2007.,附：NDM-1超级细菌,NDM1-New Dehli metallo beta-lactamase对三种以上不同类别的抗菌药物耐药叫多重耐药菌（MDR） MDR- resistance to 3 classes of antimicrobial agents Extensive Drus Restant-XDR XDR- resistance to all but 1 or 2Pan Drus Restant-PDR PDR- resistance to all antibiotics as first-line emperical therapyExtreme Drus Restant-XDR XDR- resistance to all antibiotics as first-line plus second-line drugs,超级细菌(Superplugs)指超级耐药菌,Extreme Drus Restant- -XDRPan Drus Restant -PDRExtensive Drus Restant -XDRMulti drug resistant -MDRSuperplugsPDRXDR,Mechanisms of Resistance,Inactivation of drugBeta-lactamasesAlteration of the targetPenicillin binding proteinsRibosomesDecreased permeabilityDrug efflux,R1 C NH HC H2C C C N C COOH,S,CH3,CH3,O,O,-lactamase,Site of -lactamase Activity,ESBL水解头孢菌素示意图,阴性菌耐药主要机制,产生-内酰胺酶： 主要有：-内酰胺酶、广谱-内酰胺酶（ ESBLs ）、超广谱-内酰胺酶、头孢菌素酶（Ampc酶）、金属-内酰胺酶等。 ESBLs的基因型：TEM型、SHV型、OXA型、CTX型和其他型共五型。,阴性菌耐药主要机制,产生-内酰胺酶： 主要有：-内酰胺酶、广谱-内酰胺酶（ ESBLs ）、超广谱-内酰胺酶、头孢菌素酶（Ampc酶）、金属-内酰胺酶等。 ESBLs的基因型：TEM型、SHV型、OXA型、CTX型和其他型共五型。,文献已报道的ESBL种类,TEM 132SHV 55OXA 56CTX-M 34 截止2004年1月14日,我国ESBL的主要种类,北京：CTX-M-3，CTX-M-11，SHV2上海：CTX-M-3广州：CTX-M-3，CTX-M-1TEM型在我国少见,双纸片法筛选ESBL,Etest法检测ESBL,产ESBLs菌感染的治疗,加酶抑制剂的复合药：头孢哌酮/舒巴坦 哌拉西林/三唑巴坦 严重感染碳青霉烯类：美罗培南，亚胺培南喹诺酮类：环丙沙星，左氧氟沙星联合氨基糖苷类：阿米卡星 头霉素类由于其他耐药机制影响，治疗ESBL感染疗效不肯定,基因阻遏子,细菌DNA,产生-内酰胺酶的基因被去抑制,B内酰胺酶,诱导,抗生素诱导细菌产AmpC酶机制,B内酰胺类抗生素,产生-内酰胺酶的基因被抑制,敏感菌株,暂时失活的基因阻遏子,发生突变的基因阻遏子,细菌DNA,-内酰