血液学第五章

第五章 造血检验的基础,第一节 血液病诊断中的应用,血液病是原发于造血组织或与造血组织密切相关的血液系统病变，与血液组成一样可分为血液有形成分和血液无形成分两大类疾病。造血检验要研究，或者说要解决的是血液病中有形成分所造成的各种疾病的诊断、疗效观察和预后判断问题，以及病因和发病机制等的基础研究。其中有些疾病已将造血检验技术用于临床，获得比较好的结果，有些还在探索阶段。,一、干细胞疾病血液病中的干细胞疾病的概念是随着细胞生物学和分子生物学技术的发展，在上世纪90年代提出，并被逐步认识的，目前比较一致的看法是其包括骨髓增生性疾病（MPD）、白血病（leukemia）、一部分再生障碍性贫血（AA）、阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）、原发性的骨髓增生异常综合征（MDS）、浆细胞疾病（PCD）、以及恶性组织细胞病（MH）等属此类。由于这些疾病都属于恶性或难治性疾病，对患者和医务人员来说，及时作出诊断、避免误诊就显得十分重要。这在很大程度上依赖造血检验的结果,（一） 一般造血检验的应用 一般造血检验是用光学显微镜通过对血片、骨髓涂片的普通染色（如瑞姬染色）和细胞化学染色（如POX、ASDCE和a-NBE等）对造血细胞的观察，以及通过造血组织病理学特征分析，进行相关干细胞疾病的诊断和鉴别诊断工作。,1 确诊白血病 世界范围内急慢性白血病的明确诊断首推骨髓涂片检查，这是其他检验方法不能替代的。无论对白血病定义有怎样的变化，骨髓涂片中未成熟白血病细胞异常增生是急性白血病的特征性标志；而不同阶段血细胞异常增生总是慢性白血病的诊断依据。在此基础上，造血组织的病理检查可查证有白血病细胞的灶样生长以及对正常造血组织的损害；各种细胞化学染色可以对不同系列的白血病细胞辅以形态学分类，如急性粒细胞白血病或急性淋巴细胞白血病等。同时，骨髓检查也能将白血病与各类型的类白血病反应作出鉴别。,2 该疾病的诊断过程也是与反应性（炎症）组织细胞增多的鉴别。虽然理论上只要骨髓涂片上出现异常组织细胞（一般认为有5种类型：多核巨组织细胞、吞噬性组织细胞、异常组织细胞、单核和淋巴组织细胞）就能确诊，但往往形态不好掌握，必须借助患者的临床表现来综合诊断，不少是死亡后的诊断。因此，在骨髓涂片不能确定时，及时的骨髓组织病理检查可起相当大的作用。切记在该病诊断上可考虑骨髓组织病理一起分析。,3 浆细胞病的诊断 浆细胞病包括孤立性或多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病、一过性或持续性的高免疫球蛋白血症以及浆细胞白血病。这类疾病通常以各种单克隆性免疫球蛋白增高为特征，因此，临床上有时不太关注造血的检查。其实有不少浆细胞病无明显的免疫球蛋白异常，或者是继发性的免疫球蛋白异常，以至发生误诊误治。所以必须强调造血检验中的浆细胞形态和数量观察，只有异常的浆细胞形态改变（如多核浆细胞和火焰样浆细胞）并达到一定的数量才有价值。另一方面，与其他白血病诊断不同，浆细胞在骨髓中的数量不是浆细胞白血病的诊断依据，只有外周血中浆细胞数超过白细胞总数的20%才有意义。,（一） 特殊造血检验的应用 特殊造血检验是用免疫学技术对造血调控有影响的细胞因子检测，用细胞生物学技术对造血细胞或病理细胞的体外培养检查和细胞培养后的染色体分析，以及细胞增殖、调亡检查，用分子生物学技术对相关基因突变、基因缺失和融合基因的检测等。,1 白血病的分型诊断 白血病在上个世纪主要使用形态分类分型方法，但随着研究的深入和治疗的需要，一般造血检验虽然能诊断白血病，但不能完全满足临床的需要。比如混合性白血病和未分化细胞白血病的诊断，可以借助分子生物学的方法。在白血病细胞具有髓系特征表达的基础上，出项IgH基因重排或TCR基因重排的表达，才是混合性白血病的明确依据；而分子生物学检查若不能显示任何造血系统特征基因改变的，才是真正的未分化细胞白血病。Ph染色体的确定对慢性粒细胞白血病的诊断是十分必要的，以染色体G带显色技术或FISH方法可很好地检测出ph染色。这不仅用于慢性粒细胞白血病的诊断和鉴别，在不少急性白血病中也有表现，如急性淋巴细胞白血病，Ph阳性的可达5%。当然Ph染色体也可分子生物学技术，在bcr/abl融合基因水平来确定，就像FAB-M3a中90%以上存在（15；17）及PML/RARa融和基因一样。研究发现90%的急性淋巴细胞白血病、97%的急性髓系白血病、95%的慢性粒细胞白血病、100%的Barkitt淋巴瘤和93%的非Barkitt淋巴瘤都有非随机的染色体畸变，是细胞生物学技术显示其巨大应用潜力的地方,2 再生障碍性贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿症的诊断 再生障碍性贫血中有一类是内源性干细胞缺陷引起的，此类通常被称为原发性再生障碍性贫血。这类再生障碍性贫血的诊断用一般造血检验是不行的它的确诊必须依赖造血干祖细胞培养，以确定存在CFU-CM、CFU-MK和CFU（BFU）-E的形成数减低或不能形成。对PNH而言，首要的已不再是与再生障碍性贫血区别后的诊断，而是用特殊的方法检测出有糖化肌醇磷脂锚蛋白的合成错误或分子生物学证实其存在该蛋白相关基因的缺失或突变。这种诊断既可靠，又可与干/祖细胞培养一起来确定是否存在AA-PNH综合征。,3 浆细胞病的诊断 浆细胞病用一般造血检验可以诊断，但由于它也属免疫性疾病，细胞因子大量参与疾病的各种并发症的形成。因此，对这部分患者血清细胞因子水平检测很有必要。通常会呈现IL-6增高、IL-1和TNF-b的明显波动等.另外,浆细胞病中的多发性骨髓瘤患者70%染色体呈多倍体,15%20%有bcl-1或bcl2基因重排,80%有c-mycRNA过度表达,50%有N-ras突变,二 其他血液病由于造血检验是针对造血细胞的检查，它可以是造血细胞本身的异常，也可能涉及外界因素对其的影响。因此，在大量的非干细胞性血液病中也有一定的价值。,（一） 一般造血检验的应用 在非干细胞病变的血液病中，一般造血检验大多无明确的诊断意义，但在红细胞疾病诊断中有参考价值。大量的遗传性异型红细胞增多的疾病，往往血涂片上会有提示各种球形、椭圆形、口形红细胞增多，但这些可能是各种红细胞疾病的反应，只有在骨髓检查中排除了其他红细胞病变，而这些细胞又有相当的比例（如达到红细胞数的15%20%以上），诊断才有意义。在其他反应性血细胞增多与骨髓增生性疾病的鉴别中，一般检验是可以有所作为的。无论是骨髓涂片还是骨髓组织病理检查，发现大量巨核细胞的增生或巨核细胞丛生堆积现象，在MPD的诊断上是可靠的，也就否定了反应性血细胞增多的可能。,（一） 特殊造血检验的应用特殊检验往往是针对非干细胞血液病中的饿先天性遗传性疾病所进行的。其中镰状细胞贫血中血红蛋白S的确定，必须用分子生物学技术寻找DNA编码中GAGGTG的改变，使链6位的颉氨酸被谷氨酸替代；各种珠蛋白合成速率的遗传缺陷需要对、和基因的表达检测才能确诊珠蛋白生成障碍性贫血；而杂合型珠蛋白生成障碍更需同时对多个珠蛋白肽链的基因改变同时检测，如对、基因的检测才能诊断血红蛋白Lepore病；G6PD和PK缺陷的红细胞病由于酶活性检测的不稳定性和方法多样性，最好的诊断还是用PCR技术对G-6-PD、PK基因突变和缺失的直接检查，尤其是对基因流行区域，更可检测出杂合子型；球形、椭圆形、口形红细胞增多的4.1、4.2蛋白缺失所对应的基因改变也是诊断的重要依据。,另外，继发于全身其他疾病引起的血细胞改变，往往会从造血的因子调控影响血细胞的生成。在慢性肾病的贫血时，血EPO水平是低的；炎性反应导致的IL-4、IL-1、TNF等改变,可影响细胞增殖或凋亡,对白细胞增多或减少有很大影响.,第二节 血液病治疗监测中的应用一、 造血干细胞移植的检测 近40年来,随着实验和临床血液学及其相关学科的发展,尤其是对造血发生、造血调控和移植免疫学的深入认识以及抗生素等药物的进展,使造血干细胞移植(HSCT)日趋成熟,并用于临床.目前开展的干细胞移植主要指骨髓移植(BMT),包括异基因BMT(allo-BMT) 、同基因BMT(syn-BMT) 、自体BMT(ABMT)和外周血干细胞移植(PBSCT).后者还有异体PBSCT(allo-PBSCT) 、脐带血干细胞移植(CBSCT)以及CD34细胞移植等.这些移植治疗都离不开造血检验的配合与支持.,(一) 移植治疗前的应用 无论用何种方式进行移植治疗,对患者病种的选择是比较重要的,并不是所有的血液病都适合移植治疗,也不是适合移植治疗的都能获得良好的效果.一般而言,干细胞疾病,克隆性、单基因遗传疾病的移植治疗效果比较可靠,其中再生障碍性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血的疗效更加明显;而急性白血病通常在缓解后着手移植;慢性白血病一般在静止期进行,特殊情况下,在急变时也能作移植治疗. 移植治疗前,造血和移植相关的检验就已开始.首先要进行移植配型,根据目前的进展,全相合、半相合和低相合的移植都在开展.然后是对供体的干细胞分选检验和计数检查,其中大量使用了流式细胞术来分选CD34+、CD38-或CD34+、HLA-DR-的干/祖细胞,并对这些分选细胞作绝对计数,即CD34+细胞计数.CD34+、CD38-细胞数量是差不多的,脐血中略高些,可考虑用细胞因子来提高(动员)血中的CD34+细胞.此时,IL-3、IL-11和CSF-GM的联合或单独应用是常规,血清细胞因子水平检测也是经常会作的.,移植治疗以后,造血检验的价值在于判断移植后造血重建是否成功,以及适当地提供尽可能多的移植后造血调控骨髓移植后，天内，外周血中性粒细胞恢复到.、血小板*、网织红细胞.，可视为移植成功；自体外周血干细胞移植后造血重建的变化，在天左右中性粒细胞.、血小板；异体外周血干细胞移植后，代表移植后重建的中性粒细胞和血小板数的恢复要比自体外周血干细胞移植晚些,对移植失败的认定，以移植后天内中性粒细胞绝对值.或初次移植后天中性粒细胞绝对值.，同时血小板数持续周以上为标准无论在移植前或移植后，造血干祖细胞培养是常用的手段移植前培养可了解供体干细胞形成集落的能力，在供体干细胞量不足时，可用此方法进行体外扩增来增加移植成功的机会；移植后培养可了解造血重建的潜能，必要时在体外辅以细胞因子，而后选择合适的细胞因子对阍者进行造血调控,二 常规化疗的监测 化疗即化学药物对血液病的治疗，这里主要指化学药物对恶性血液病或干细胞疾病的药物诱导缓解治疗。（一） 造血一般检验的应用化疗对白血病等干细胞病变是必不可少的治疗手段急性白血病化疗诱导获得缓解时，骨髓涂片中白血病细胞（非红系有核细胞计数）这通常视为骨髓缓解，此时，可进入巩固强化治疗阶段但有时骨髓涂片上的缓解不等于真正的骨髓中缓解，骨髓组织病理检查还可能发现局灶性白血病细胞这种情况下，加强和调整化疗方案就有了依据在化疗时，骨髓组织病理检查发现的未成熟前体细胞异常定位（）是否改变，是化疗有效与否的一个指标同样，在的化疗或治疗前都有可能在骨髓组织病理检查中发现，这些患者在有效治疗后可发现消失,（一） 造血特殊检验的应用化疗药物的选择利用造血一般检验对白血病分类和分型后，可初步选择一个诱导缓解方案如急性髓系白血病常用柔红霉素阿糖胞苷的所谓方案；成人急性淋巴细胞白血病则首选方案，即长春新碱泼尼松但利用特殊检验中的细胞体外培养技术，可针对性地观察体外化疗药物对白血病的影响来指导体内用药，当然体内体外是有差异有时，特殊的染色体和融合基因检查也有独特的应用价值在的患者，t(15;17)并存融合基因的全反式维甲酸治疗效果就好；而非此类型的，全反式维甲酸诱导化疗效果就差.凋亡治疗的选择化疗的效果，与细胞类型有关，也与凋亡的抑制有关利用凋亡检测和分子生物学技术bcl-2等抑制凋亡基因表达的分析，可考虑对存在凋亡抑制的患者用氧化砷或rhIL-4等药物,.耐药性检测与逆转利用分子生物学技术检测多药耐药基因（）及相关蛋白p、肺多药耐药蛋白（）基因、拓扑异构酶介导的、谷胱甘肽转移酶介导的和蛋白激酶介导的等这些耐药的存在，化疗会很困难，预后也差临床上可考虑加用逆转药物，如钙通道阻滞剂、环孢菌素、奎宁类、长春新