《实验细菌转化》PPT课件.pptVIP

实验一细菌质粒DNA的提取和纯化 一 实验目的 通过细菌质粒DNA的提取 掌握共价闭合环状DNA的提取方法 二 实验原理 细菌中有两种DNA 即染色体DNA和质粒DNA 质粒DNA的提取方法有三种 碱裂解法 煮沸法和去污剂 如Triton和SDS 裂解法 碱裂解法比较剧烈 可破坏碱基配对 使宿主细胞DNA变性 共价闭合环状DNA由于空间缠绕 两条链不会彻底分开 当外界条件到达复性条件时 质粒DNA的双链又迅速恢复原状 而较大的线性染色体DNA难以复性 三 实验菌株 含质粒载体pGEM T的大肠杆菌 E coli 四 实验用具和药品 实验用具摇床 离心机 移液器及枪头 玻璃试管 15mL 及塞子 离心管 1 5mL 实验药品 五 实验步骤 方法 活化 扩增 离心 裂解 离心 抽提 沉淀 洗涤 溶解 一 细菌繁殖实验前2天晚上 将冻存的菌株取出 划线接种于LB amp 平板上 置于37 培养箱中 倒置培养至菌落长成 实验前1天晚上 从LB平板上挑取单个菌落 接种于6mlLB液体培养基 加入氨苄青霉素 中 37 过夜振荡 200r min 培养 二 菌体收集实验当天 将过夜培养的菌体转入1 5mL离心管 5000r min离心2min 弃上清 三 碱裂解法提取质粒DNA全套操作约需1小时 详细说明如下 3 加入250 l的Solution 含RNaseA1 充分悬浮细菌沉淀 注 注意不要残留细小菌块 可以使用振荡器 Vortex 等剧烈振荡使菌体充分悬浮 4 加入250 l的Solution 轻轻地上下翻转混合5 6次 使菌体充分裂解 形成透明溶液 注 此步骤不宜超过5分钟 5 加入400 l的4 预冷的Solution 轻轻上下翻转混合5 6次 直至形成紧实凝集块 然后室温静置2分钟 6 室温12 000rpm离心10分钟 取上清 注 此时4 离心不利于沉淀沉降 7 将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上 8 将上述操作6的上清液转移至SpinColumn中 12 000rpm离心1分钟 弃滤液 9 将500 l的RinseA加入SpinColumn中 12 000rpm离心30秒钟 弃滤液 10 将700 l的RinseB加入SpinColumn中 12 000rpm离心30秒钟 弃滤液 11 重复操作步骤10 12 将SpinColumn安置于CollectionTube上 12 000rpm离心1分钟 13 将SpinColumn安置于新的1 5ml的离心管上 在SpinColumn膜的中央处加入60 l的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer 室温静置1分钟 注 把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60 使用时有利于提高洗脱效率14 12 000rpm离心1分钟洗脱DNA 六 实验作业 按上述实验步骤提取质粒DNA 思考本实验的关键步骤是什么 答 本实验的关键是溶液 重悬须充分 溶液 混合须温和 实验二大肠杆菌的遗传转化 一 实验目的 通过实验了解原核生物实现基因转移的途径 掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法 二 实验原理 转化 transformation 是指一种生物由于接受了另一种生物 或同种生物 的遗传物质 从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态 用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程 目前应该较广的转化方法有两种 CaCl2转化法 化学转化法 和电转化法 CaCl2转化法的原理是在低温 0 和低渗的CaCl2溶液中 菌体膨胀 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基 钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面 经42 短时间热击 促进细胞吸收DNA复合物 三 实验材料 质粒pGEM Teasy 编码氨苄青霉素 Ampr 的抗性基因大肠杆菌 E coli DH5 菌株 氨苄青霉素敏感型 Amp 四 实验用品 超净工作台 摇床水浴锅 离心机分光光度计 移液器及枪头三角瓶 500mL 200mL 离心管 50mL 1 5mL 平板 Ampr Amp LB培养基冰冷的CaCl2溶液 质粒DNA 0 1MCaCl2溶液配制 称量1 11g无水CaCl2固体 溶于1000ml双蒸水中 高压灭菌或0 22um滤器过滤除菌 保存于4度冰箱中 质粒的提取 利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA 五 实验步骤 一 感受态的制备 此步骤已完成 1 E Coli涂布于平板 Amp 37 培养12h 2 挑取单菌落 转移至盛有200mLLB的500mL三角瓶中 37 振荡 200r min 培养12h 3 吸取1mL菌液 转移至盛有100mLLB的200mL三角瓶中 37 振荡 200r min 培养2 3h 每隔0 5h测OD600值 4 当OD600 0 3 0 4 对数生长期的OD600 0 6 取出 冰上放置10 60min 5 4 5000rpm 离心10min 弃上清 6 冰预冷的0 1mol LCaCl210mL悬浮细胞 7 冰上放置15min 8 4 5000rpm 离心10min 弃上清 9 冰预冷的0 1mol LCaCl22mL悬浮细胞 10 用于转化实验 若需保存 加入终浓度15 的甘油 70 保存 二 转化 冰上操作 1 1 5mL管中加入感受态细胞50 L和待转化的质粒2 L 冰浴30min 2 42 热击90sec 勿晃动管子 3 冰浴2min 4 加入37 预热的LB至1mL 5 37 振荡 50r min 培养2h 6 取200 L涂板 Ampr 37 培养12 16h 7 对生长出的白色菌落计数 计算出每微升质粒的转化率 六 实验作业 计算出大肠杆菌的转化率 转化率 平板上的白色菌落数 2 L 转化过程中 会不会出现假阳性的结果 为什么 如何排除 答 转化过程中 经常出现假阳性 原因很多 如质粒 菌株不纯 载体自连等 详细的解释见 分子遗传学 准备工作 1 培养板和菌株准备实验前2天 制备LB液体培养基 LB固体培养基 含amp 若干 每组一个LB平板 灭菌TEbuffer 或双蒸水 将冷冻的pGEM T载体菌株取出 划线接种至LB平板 amp 培养前1天 培养18 24h后 挑单菌落接种至LB液体培养基 含amp 若需制备感受态 时间同上 另需准备LB平板