树突细胞和调节性T细胞的研究进展

基因公司市场部张 姿,DC细胞和调节性T细胞研究新进展,树突细胞篇,树突细胞（Dendritic Cell；DC）,树突细胞根据其独特形态而得名, 是目前功能最强大的抗原递呈细胞(APC),Important surface molecules of DC,树突细胞膜表面分子,MHC-II,黏附分子,CD1a 抗原呈递,DC的起源和分类,小鼠体内DC根据其起源、功能和分布情况主要分为髓系DC和淋巴系DC两种，分别用CD11b和CD45R/B220区分人体DC至少可以分为与小鼠类似的两群：DC1和DC2外周血前体细胞可分为来源于外周血单个核细胞的前体细胞pDC1和来源于血液或者扁桃体的类浆细胞的前体细胞pDC2,人DC分类,髓样DC(MDC)不表达lin(CD19、CD20、CD56、CD14、CD3) 但高表达HLA-DR及CD11c;浆细胞淋巴样DC(PDC) 不表达lin(CD19、CD20、CD56、CD14、CD3) 高表达HLA-DR及CD123. 活化DC上调CD40 、CD80 、CD86,人外周血树突细胞髓系和淋巴系亚群分析,人外周血DC主要分为CD123+和CD11亚群 3-color assaylin 1 FITC (Cat No. 340546)、CD123 PE (Cat No. 554529)、CD11C PE (Cat No. 555392)、AntiHLA-DR PE-Cy5 (Cat No. 555813)、Mouse IgG1 PE (Cat No.555749)、Mouse IgG2a PE (Cat No.555574) 4-color assaylin 1 FITC、CD123 PE 、CD11c APC (Cat No. 559877)、AntiHLA-DR PerCP、Mouse IgG1 PE 、Mouse IgG2a APC(Cat No.555576),人外周血DC1和DC2的鉴定,4-Color AssayR3: lin-HLA-DR-CD123+嗜碱性粒细胞R4：lin-HLA-DR+CD123+淋巴系细胞DC（DC2）R5：lin-HLA-DR+CD11C+髓系DC（DC1）,小鼠DC分型,名称 货号Anti-mouse B7-DC (CD273) PE 557796Rat IgG2a, PE isotype control 554689anti-mouse CD11b FITC 553310 / 557396anti-mouse CD11c APC 550261 CD45/B220 PerCP 553093Anti-mouse IFN-PE 554412,Splenic dendritic cells (DCs) express B7-DC (Nguyen, L.T., et al. 2002.J. Exp. Med.),DC的生物学特征,DC主要激活静息型Tcell, 也可诱导繁殖型T细胞激发获得性免疫Diaz-de-Durana et al. (Blood.2006)等发现 DC与B细胞之间通过BLys激活B细胞和嵌合的Fc-TACI蛋白信号促使DC成熟DC激活巨噬细胞、NK细胞、NK-T细胞和嗜碱性粒细胞引发自然杀伤反应淋巴系DC通过快速分泌IFN-和IFN-对特定病毒产生应答DC与Th细胞的关系,DC的分化过程,成熟和未成熟DC比较,DC的表型分析,体外培养的MDDC (Monocyte derived DCs) 表型分析BDTM CD86/CD209 /CD83 组合CD209 PE Cat.No. 551265CD86 PE-Cy5 Cat.No. 555659/555666CD83 APC Cat.No. 551073 CD14 Alexa Fluor 488 (Cat. No. 557700),DC功能分析,DC功能分析主要包括胞内外细胞因子检测和混合淋巴细胞刺激反应胞内流式：胞内细胞因子：BD Cytometric Beads Array (CBA)：胞内外细胞因子同种混合淋巴细胞刺激反应(Allo-MLR) ：用细胞因子流式法结合BrdU掺入法检测DC刺激同种异体T细胞的能力同源的抗原特异性T细胞的刺激能力：同上,举例1：MDDC胞内因子COX分析,LPS炎性刺激诱导未成熟MDDC大量表达COX-2，而成熟MDDC组成性表达COX-2,外周血DC,举例2：外周血DC和MDDC对LPS 应答产生IL-12,举例3：CBA检测DC细胞因子,Cytometric bead array 检测Ly49Q+和Ly49Q 小鼠类浆细胞前体DC分泌细胞因子的能力,(Omatsu Y, Iyoda T, Kimura Y et al. J. Immunol. 2005 ),举例4：MDDC的同种混合淋巴细胞刺激反应,小鼠DC研究相关Marker,P plasmacytoid DC M myeloid (conventional) Mat mature DC imm immature 表达高于,人类DC分析相关Marker,DC的获取和培养,CD34+祖细胞位于骨髓、脐带血和成年人外周血中，在细胞因子如GM-CSF、TNF-培养条件下可以发育为DC外周血CD14 + 单核细胞在GM-CSF 和IL-4 的条件下可以分化发育成DC，现多采用，主要因为取材广泛、培养方便外周血中CD34-前体细胞可以诱导出大量的DC，具有成熟DC所有的特征高度纯化的乳铁蛋白阳性的终末期中性粒细胞的前体细胞加入GM-CSF、IL-4和TNF-可形成DC 样细胞白血病细胞成功诱导出DC, 具有较强的刺激混合淋巴细胞反应能力,组织来源 骨髓 新生儿脐带血 流动的外周血干细胞 贴壁外周血细胞分离方法 密度纯化法（density-based purification） 磁分选和免疫分选 使用钙离子筛（calcium ionophore,CI）,DC的体外分离,BD IMAG 树突细胞磁分离系统,常用的细胞因子GM-CSF、IL-4 、TNF-其他刺激因子IL-1、IL-6、PGE-2、IL-13、SCF、Flt-3配基、CD40L、TGFb、c-kit配体肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor; HGF)、PMA 培养辅助试剂Mouse BD FcBlock purified CD16/CD32 mAb Cat. no. 553141/553142 human GM-CSFCat. no. 550068human IL-6 Cat. no. 550071 mouse GM-CSF Cat. no. 554586mouse IL-6Cat. no. 554582 rat GM-CSF Cat. no. 555111rat IL-6Cat. no. 557008 human IL-4Cat. no. 554605human TNF Cat. no. 554618 mouse IL-4 Cat. no. 550067mouse TNF Cat. no. 554589 rat IL-4 Cat. no. 555107rat TNF Cat. no. 555109 mouse IL-13Cat. no. 554599,培养条件,外周血单核细胞体外培养诱导产生DC,HBV慢性感染主要原因,HBV特异细胞免疫功能的低下,T细胞,树突状细胞（DC）,慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能异常,促进DC成熟、恢复DC的功能,增强DC激活特异性抗病毒免疫反应,打破免疫耐受彻底清除病毒,研究示例,特异性CTL数量少低反应,获得高频数、功能强HBV特异性的CTL,DC疫苗,前列腺癌树突状细胞疫苗已经完成III 期临床研究我国大肠癌DC治疗性疫苗进入II期临床Baylor免疫研究所获得3千万美元资助进行黑素瘤疫苗的研制2002年，中法合作用DC疫苗成功治疗猴艾滋病2006年，华裔科学家何大一获盖茨基金会2500万研究艾滋病DC疫苗新型丙肝疫苗糖尿病的DC治疗进入FDA临床I安全性期检测,DC与肿瘤的关系,DC肿瘤疫苗的原理：在体外被肿瘤负载的DC所诱导的T淋巴细胞反应是肿瘤特异性的，且对自身淋巴细胞无直接损伤；肿瘤病灶中的浸润型DC可以处理和提呈抗原并激活抗肿瘤免疫肿瘤的免疫主要逃逸的机制：肿瘤病人中DC数量减少和功能缺陷，无法激发细胞毒性T细胞（CTL）DC疫苗正取代其他治疗癌症的方法,DC肿瘤疫苗的制备,临床治疗DC准备的QC标准细胞纯度（血液来源的DC）70% (lin-DR+)细胞纯度 (MDDC)90% (CD14-lin-DR+)细胞纯度 (骨髓来源的DC) 50% (CD34+)活化DC标志 80% CD86和CD83依赖于操作活性90% (新鲜)50% (冰冻)功能刺激T 细胞的能力-同种抗原-特定抗原 抗原负载DC的策略合成抗原肽冲击DC肿瘤完整抗原或者肿瘤裂解物冲击DC凋亡或者坏死的肿瘤细胞冲击DC完整的肿瘤细胞融合DC载体转染mRNA冲击DC刺激性因子或者共刺激因子基因转染,DC疫苗存在问题和展望,1成熟或未成熟DC?2DC来源 单个核细胞源性或CD34+前体细胞源性DC和外周血DC 3DC剂量 大多数报道中DC剂量为11065107个细胞，长效地刺激免疫反应剂量？4抗原选择目前尚无定论5输入途径静脉、淋巴结和肿瘤部位,参考文献,Xie J, Wang Y, et al. Beta 2-microglobulin as a negative regulator of the immune system: high concentrations of the protein inhibit in vitro generation of functional dendritic cells. Blood. 2003 15:4005-12. Davidson DJ, Currie AJ, et al.The cationic antimicrobial peptide LL-37 modulates dendritic cell differentiation and dendritic cell induced T cell polarization. J Immunol. 2004 15:1146-56.Su Z, Dannull J, et al. Telomerase mRNA-transfected dendritic cells stimulate antigen-specific CD8+ and CD4+ T cell responses in patients with metastatic prostate cancer. J Immunol. 2005 15; 3798-807.Galea-Lauri J, Wells JW, et al.Strategies for antigen choice and priming of dendritic cells influence the polarization and efficacy of antitumor T-cell responses in dendritic cell-based cancer vaccination. Cancer Immunol Immunother. 2004 53:963-77.Pillarisetty VG, Shah AB, et al.Liver dendritic cells are less immunogenic than spleen dendritic cells because of differences in subtype composition. J Immunol. 200415:1009-17.Samsom JN, van Berkel LA, et al.Fc gamma RIIB regulates nasal and oral tolerance: a role for dendritic cells. J Immunol. 2005 174:5279-87.Omatsu Y, Iyoda T, et al.Development of murine plasmacytoid dendritic cells defined by increased expression of an inhibitory NK receptor, Ly49Q. J Immunol. 2005 174:6657-62.Rohn TA, Boes M, et al.Upregulation of the CLIP self peptide on mature dendritic cells antagonizes T helper type 1 polarization. Nat Immunol. 2004 5:909-18,调节性T细胞篇,调节性T细胞介绍,调节性T细胞（Treg）是具有免疫调节功能的T细胞, 其作用的使机体能通过免疫耐受控制自身性疾病,调节T分类及生物学特征,人体中有CD4调节性T细胞、CD8调节性细胞和Th3细胞、Tr1细胞天然调节性T细胞经自身抗原刺激后在胸腺内被阳性选择，对自身抗原具有高亲和力占CD4T细胞群体的5-10抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖Tr1和Th3在外周发育，表型都为CD4+CD25-FoxP3-，体外用TGFb刺激可转化为 CD4+CD25+FoxP3+CD8+调节T研究还不充分，有报道称它经CD3刺激后可抑制CD4T细胞的增殖,调节T细胞免疫调节机制,天然Treg 通过接触抑制方式抑制T细胞的活化和增殖分泌细胞因子IL-10和TGF-抑制免疫反应 Trl和TH3主要是通过分泌IL-10和TGF-来下调免疫反应,细胞介导的免疫反应,天然调节T细胞在免疫系统中的作用,Treg细胞分析三个阶段,CD4+CD25+,CD4+CD25+FOXP3+,T细胞活化后也表达CD25,FOXP3过度表达会引起机体的免疫应答下降，它是一个调节T细胞活性的主要转录因子,CD127+CD4+CD25+,Nature Reviews Immunology 6, 572 (August 2006),The authors concluded that using a combination of CD4, CD25 and CD127 results in highly purified T regCell population.,CD127表达识别人调节性T细胞,最新发现调节性T细胞下调表达CD127。CD127是IL-7受体一部分，在T细胞前体、B细胞前体、成熟T细胞、成熟单核细胞其他一些淋系和髓系细胞上表达。IL-7R在T细胞的增殖和分化和成熟中起重要作用体内实验发现T细胞活化后CD127蛋白下调表达，且T细胞CD127的下调表达与CD25中等-强表达具有良好的相关系通过胞浆FoxP3染色证实CD127可用于识别调节性T细胞,FoxP3与CD127的相互作用,通过ChIP和Affymetrix芯片技术发现，FoxP3与CD127（IL-7R）的基因序列结合，抑制其转录表达。从而也证明了Foxp3阳性与CD127低表达有相关性。,流式分析人外周血单核细胞中Treg,( J. Exp. Med. 2006;1701-1711),1、明显优于检测胞浆内FoxP3 ，排除破膜影响，适用于体外培养与分析2、分选所得的T 调节性细胞得率明显增加，一般CD4+CD25+其得率往往在0.6%到7.9%之间；使用低表达CD127 联合CD25，结合设门方法可获得CD25 低表达的调节性T 细胞，从而使得率提高2-4 个数量级而不含有CD25 中等表达的非调节性T 细胞。,CD127代替Foxp3的优势,CD127loCD25hi-int 与FoxP3阳性一致使Treg得率增加2-4个数量级分析后细胞仍然存活方便细胞分选和后期培养操作简单，结果更准确可靠,调节T细胞与I型糖尿病关系,今年6月发表在J. Exp. Med. 2006的文章通过流式计算正常人和糖尿病病人血中T reg的含量发现,调节T对效应T的抑制作用,Results are represented as counts per minute (CPM),通过T reg与T 效应细胞在cell culture insert进行共培养，发现T