医学科研基础酶学2011.9

1,Department of Biochemistry and Molecular Biology,Dalian Medical University,刘淑清 基础医学院423,2,医学科研基础酶学,酶的提取与纯化酶的活性测定酶实验中的酶动力学酶偶联测定法（酶联免疫测定法ELISA )别构酶同工酶抗体酶模拟酶基因工程中的工具酶,Fundamentals of Enzymology for Scientific Research of Medicine,3,关于酶学的诺贝尔奖,1907年 “没有酵母细胞的醇发酵”1929年 “辅酶I（NAD+）的发现” 1931年 “发现呼吸酶的性质和作用方式”1946年 “脲酶结晶并具有蛋白质的所有性质” 1947年 “发现糖代谢中的酶促反应”1955年 “过氧化酶的研究” 1957年 “核酸酶以及核酸辅酶的研究”1959年 “DNA和RNA聚合酶”1965年 “研究有关酶和细菌合成中的遗传调节机构” 1972年 “核糖核苷酸酶的活性区位研究”1975年 “酶催化反应的立体化学”1978年 “发现限制性内切酶以及在分子遗传学方面的 应用”1989年 “核酶（ribozyme)的发现”2009年 “端粒和端粒酶是如何保护染色体的”,4,Jean-Franois Persoz(1805 1868),Anselme Payen(1795-1871),1833年在巴黎一个糖厂工作的Payen和Persoz从麦芽中分离出一种可使淀粉转变为糖的可溶性物质，即淀粉酶（diastase，后来化学家称为amylase）。,有关酶的故事,科研来源于生活,5,Justus Liebig (1803-1873 ),Louis Pasteur(1822-1895),1860年法国伟大的微生物学家和化学家Pasteur认为，发酵是与活的酵母细胞不可分割的，此学说称为活力论（vitalistic dogma）。当时Liebig(出版过世界上第一部生物化学著作“organic chemistry in its application to agriculture and physiology”)则认为发酵是某种化学物质作用的结果，与活细胞无关。这场争论持续了40年。,科研存在争论,6,Wilhelm Khne(1837-1900),1878年，Khne库因提出用enzyme代替争论双方提出的引起发酵的酵素。Enzyme来自希腊文 u ，“在酵母中”（in yeast）之意。 1897年，德国化学家Eduard Buchner出于治疗的目的制备了无细胞的酵母提取液，并用蔗糖加以保存。这是当时厨房化学（kitchen chemistry）的常用方法。他们惊奇地发现，蔗糖很快被发酵成乙醇，于是他们进一步证明了发酵可以不依赖活的酵母细胞。这一发现彻底摧毁了活力论学说，打开了通向现代生物化学与现代酶学的大门。,Eduard Buchner(1860-1917),科研要有总结验证,7,Leonor Michaelis(1875-1949),Maud Menten(1879-1960),1913年，Leonor Michaelis和Maud Menten提出了单底物反应的酶促反应动力学模式。即著名的米-曼氏动力学方程式。为以后酶促反应动力学研究奠定了数学基础。1926年1930年Sumner将脲酶制成结晶，确定了酶的蛋白质本质，从些拉开了蛋白质结构与功能研究的序幕。,8,第一个证明酶是蛋白质的人是美国 生物化学家萨姆纳（Lames B. Sumner， 1887-1955）。萨姆纳17岁时因玩枪不慎 失去了左臂。他不顾反对，坚持学习化 学。博士毕业后，他成为康内尔大学的 助理教授。他以顽强的毅力和勇气，坚持 为自己确定的宏伟目标：纯化脲酶。尽管 遭到权威教授的反对，他还是经过十余年的不懈努力，于1926年终于从南美热带植物刀豆中纯化出脲酶结晶。纯化液的酶活性比原液高700倍。脲酶结晶具有蛋白质的所有性质。3年后，诺思罗普（John H. Northrop）证实了萨姆纳的发现，并结晶出许多酶。后来斯坦利（Wendell M. Stanley）则利用他们的方法，将病毒结晶出来。从而拉开了蛋白质结构与功能研究的序幕。 由于当时检测技术的限制，无法确认他们得到的结晶的纯度。直到电泳和超离心发明以后，他们的成果才被承认。于是20年后，萨姆纳与诺思罗普、斯坦利才同获1946年的诺贝尔化学奖。,科研是艰辛的,9,第一章 酶的提取与纯化,提取： 除在体液中提取酶或胞外酶外，一般都要选用适当的方法，将含目的酶的生物组织破碎，促使酶增溶溶解，最大程度地提高抽提液中酶的浓度。提取是使酶进入水溶液的过程。,纯化： 去除溶液中除目的酶以外的各种蛋白质和其他生物大分子的过程。,（Extraction and Purification of Enzymes）,10,一、酶的来源 (The Source of Enzymes),根据不同的目的，对酶的来源有不同的选择。,1.针对性取材：针对所研究的特定组织器官中特定的酶，没有选 择的余地。,2.非针对性取材：为了得到特定的酶，但不限制酶的来源。这样，应寻找酶的来源丰富、含量高、取材容易、提取、方便、价格低廉的材料。,取出的组织应在低温下保存、运输，并尽快地提取。防止酶的变性、防止细菌的繁殖、防止组织自溶。,目前，利用动、植物细胞体外大规模培养技术，可以大量获得极为珍贵的原材料（如人参细胞、某些昆虫细胞等），用于酶的分离纯化。利用基因重组技术能够使某些在细胞中含量极微的酶的纯化成为可能。例如大肠杆菌芳香族氨基酸的合成所需的丙酮酰莽草酸磷酸合成酶可以通过基因重组入多拷贝质粒pAT153，将此质粒转入大肠杆菌，产生一种比野生型大肠杆菌株高100倍的含此合成酶的新菌株。从而提高大肠杆菌合成芳香族氨基酸的速率。,11,二、酶的提取方法（Methods for enzyme extraction）,破碎细胞的一般方法,技术 举例 原理,温和型 溶胞作用 红细胞 细胞膜渗透压破碎 酶解 细菌的溶菌酶处理 细胞壁被酶解消化,渗透压作用 化学溶解/自溶 酵母的甲苯抽提 细胞壁被部分化学试剂溶解,胞内溶解酶释放 手工匀浆 肝组织 细胞被强制通过狭小的间隙,撕裂细胞壁 绞碎(磨碎) 肝,肌肉等等 细胞因剪切力而绞碎 中等型 高速组织捣碎机 肌肉和大部分动植物 剪切力打破大的细胞,剪切开小的细胞 加有研磨剂的研磨 (石英砂,氧化铝) 植物组织,细菌 微磨擦撕破细胞 剧烈型 法兰西压榨机 细菌,植物组织 细胞被高压强制通过小孔,剪切力破碎细胞 超声作用 细胞悬浮液 微型高压声波通过剪切力和空穴作用导致 细胞破碎 球磨 细胞悬浮液 玻璃珠的快速振动,撕破细胞膜 高压匀浆泵 细胞悬浮液 原理同法兰西压榨器,但规模较大,机械(匀浆)法、超声波法、冻融法、渗透压法、酶消化法。,12,（一）可溶性酶的提取,1.打破细胞膜,动物组织在等渗介质中匀浆可使细胞质膜破坏除内质网外，其他细胞器是完整的；匀浆、冻融、超声和真空干燥可使质膜和细胞器膜破坏。,高等植物,谷类面粉：在溶液中搅拌； 软质贮存器官（如土豆）：切碎、挤出汁液； 植物叶子和干的种子：研碎，在合适的溶液中捣 成匀浆，也可在丙酮中进行匀浆后制成丙 酮干粉。二氧化碳临界萃取法。,13,1）化学方法,碱溶液：提取在高pH下稳定的酶， 如L-天冬酰胺酶。,酶消化法：例如，溶菌酶(lysozyme)专一催化细菌细胞壁粘多糖-1,4糖苷键的水解。对革兰氏阳性菌的敏感性高。常与EDTA合用，因为EDTA可夺走使细胞壁稳定的二价阳离子，有利于溶菌酶的作用。溶菌酶作用温和，可以来自鸡蛋清。此外，蛋白水解酶、糖苷酶等对细胞膜或细胞壁也有溶解作用，使细胞崩解破坏。,去垢剂：分离子型、非离子型。去垢剂与膜上的脂蛋白结 合，将细胞膜上的脂蛋白溶解，增大膜的通透性。离子 型去垢剂的反应性比非离子型强，可以使蛋白质变性、 沉淀、甚至水解。此外，去垢剂还可使酶的盐析沉淀发 生困难。,14,A. Ionic detergents:,Anionic detergents:,Sodium Dodecylsulfate,Sodium dodecylsulfonate,Cationic detergents:,Cetyltrimethylammonium bromide,B. Non-ionic surfactants,Polyoxyethylene p-t-octyl phenol (Triton X series),Polyoxyethylene sorbitol esters (Tween series),十二烷基硫酸钠,十二烷基磺酸钠,十六烷基三甲基溴化铵,15,2)物理方法,超声（音频在20千赫以上，波长在6-2.4104cm）作用于液体会产生“空穴作用”，出现压缩区和稀疏区。稀疏区产生的空穴在稀疏区转为压缩区时迅速崩解。这样空穴中的产生的气泡被压缩达几千个大气压，紧接着产生的冲击波对细胞产生破坏力。超声的主要问题是超声空穴局部过热引起酶变性。,渗透压法、冻融、干燥、风干（30C，数天）、冷冻干燥等均可达到对细菌细胞壁的破坏作用。此外，研磨、加压等也可奏效。,机械（匀浆）法：利用机械力的搅拌，剪切、研碎细胞。 玻璃或Teflon研棒匀浆器（Potter-Elvehiem homogenizer）可处理 容量达50ml； 高速组织捣碎机（Waring blender）容量可达5001000ml; 高压匀浆泵（Manton-Gaulin）适用细菌、真菌（如酵母）的破 碎，容量可达数升； 高速球磨匀浆器或直接研钵研磨等。,16,2亚细胞结构的分离,差速离心法（differential centrifugation）：根据不同细胞器的沉降系数不同，采用离心力分别由小到大，将不同的亚细胞结构分阶段进行分离。,匀浆,1000g, 5,沉淀（未打碎的真核细胞）,上清,沉淀（细胞碎片、细胞核）,上清,4000 g,10,15000 g,20,沉淀（线粒体、细菌）,上清,30000 g,30,沉淀（溶酶体、菌体碎片）,上清,沉淀（微粒体）,上清,100000 g,90,沉淀（核糖核蛋白体）,胞液,100000 g,180,g1 t1 = g2 t2,(rpm)12 t1 = (rpm)22 t2,RCF(g) = 1.119 10-5 rpm2 r,g = gravity,17,亚细胞结构的鉴定,除电子显微镜外，可以用标志酶来鉴定亚细胞结构。,亚细胞成分,标志酶,细胞核,尼克酰胺单核苷酸腺苷转移酶（焦磷酸化酶）,线粒体,琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶单胺氧化酶、谷氨酸脱氢酶,溶酶体,酸性磷酸酶、葡糖苷酸酶芳香基硫酸酯酶,内质网,葡糖磷酸酶、细胞色素还原酶,胞液,乳酸脱氢酶,18,（二）膜结合酶的提取,外在蛋白（peripheral protein）靠静电引力或氢键与膜结合，可用高离子强度的溶液（如aCl）、冻融、超声处理。,内在蛋白（integral protein）与脂类的疏水键相结合，形成脂蛋白复合物，可用丙酮粉、特异的酶（如磷脂酶、甘油三酯酶）、去垢剂、有机溶媒等提取。,正丁醇是提取膜结合酶常用的有机溶剂。它具有亲水和疏水性，在不同条件下可提取不同的酶。在pH时可提取碱性磷酸酶，在pH时可提取谷氨酰转肽酶，在pH10时提取尿酸氧化酶。,19,（三）抽提液的选择 典型的抽提液由以下七方面组分组成（可根据需要予以取舍）：,抽提液包括： 离子强度调节剂：KCl、NaCl、蔗糖(细胞内的离子强度=0.3mol/L) pH缓冲液：各种缓冲液 温度效应剂：甘油、二甲亚砜 蛋白酶抑制剂： 苯甲磺酰氯（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、二异丙基氟磷酸（异氟磷， diisopropyl fluorophosphate，DIFP) 抗氧化剂：二硫苏糖醇（dithiothreitol DTT）、-巯基乙醇(2-mercapto- ethanol -ME) 重金属络合剂：EDTA、柠檬酸 增溶剂：TritonX-100、脱氧胆酸盐,20,提取液的性质对酶提取的影响,提取液中把握蛋白质溶解度的因素主要有四个方面：,1盐的浓度要使酶稳定，而其他蛋白质不稳定；,2pH要远离pI，但不能影响酶的稳定性；,3有机溶媒含量使酶稳定，其他蛋白质不稳定；,4提取液的温度应控制在以下，防止酶变性。,此外，溶液中增加底物可以提高酶的溶解度，加入稳定剂（stabilizers），如二硫苏糖醇（dithiothreitol）或-巯基乙醇（ -mercaptoethanol）等防止巯基氧化；加入蛋白酶抑制剂可以防止所提取的酶被水解。,21,举例：,牛肝谷氨酸脱氢酶精氨酸酶碱性磷酸酶酸性磷酸酶,溶于19%乙醇，pH5.8,离子强度0.02,过氧化氢酶过氧化物酶氨基酸氧化酶,不溶于上述条件。但在pH5.8,无乙醇和离子强度0.15时可溶。,各种蛋白酶,不溶于上述两种条件。但第二个条件中，将pH改为7.4可溶。,22,四、酶的纯化,（一）纯化方法,Properties,Methods,Size or Mass,CentrifugationGel filtrationDialysis, Ultrafiltration,Charge,Ion-exchange chromatographyElectrophoresisIsoelectric focusing,Solubility,Change in pHChange in ionic strengthDecrease in dielectric constant,Specific binding sites,Affinity chromatography,Affinity elutionImmunoadsorption affinity chromatography,Others,liquid chromatographyGas chromatographyAdsorption chromatography,23,24,改变pH和温度：调节溶液pH至等电点，酶沉淀下来。但未纯化前的等电点一般是不知道的。需慢慢摸索。对某一特定的酶而言，pH变化不宜过大，以免酶的失活。 改变温度来纯化酶的方法难以控制。但对于热不敏感的酶，这一方法有着不可比拟的优点。如在纯化Cu,Zn-SOD时，将溶血液在70C加热10分钟，很多杂蛋白变性除去，SOD仍稳定存在于溶液中。改变温度应该迅速，以免酶发生变性。,25,改变介电常数：在溶液中加入与水互溶的有机溶剂（如乙醇、丙酮等）可显著地降低溶液的介电常数，从而使酶分子相互之间的静电作用加强而发生沉淀。注意：应在低温下操作，即可降低酶的溶解度又可防止酶的变性。此法比盐析法提纯度高，仅用这一方法便可使一些酶纯化。有的酶即使温度再低，一遇到有机溶剂便出现大量失活。 聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）也可视为有机溶剂，但其性温和，不使酶变性。常用PEG的分子量为4000或6000，浓度达20%时，大部分蛋白质可沉淀。 目前，人们采用“双水相萃取”法，把PEG与一些配对使用的物质，如右旋糖苷、无机盐（磷酸钾、硫酸铵）在水中达一定浓度时能形成两相系统。蛋白质在这两相中具有不同的分配系数，改变组成两相的溶质浓度就可调节各种蛋白质在两相间的分配系数，从而得以萃取分离。,PEG,硫酸铵,26,2.根据酶分子大小、形状不同的分离方法,离心分离：先采用差速离心法分离亚细胞结构，如细胞核、线粒体、溶酶体等。这可使酶先浓缩1020倍。盐析沉淀和有机溶剂沉淀选用4000 6000g已足够。 凝胶过滤：Sephadex G 系列、Bio-Gel AP系列和Sepharose等 透析和超滤： 透析：透析袋截留极限一般在Mr为5000左右。如果将相对分子质量在1万以下的酶液进行透析时，就有泄露的危险。,27,超滤(ultrafiltration)：在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。,28,3.根据酶分子电荷性质的方法,离子交换柱层析：根据不同的被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力不同来进行分离的方法。 装柱前应进行转型处理： 阳离子交换剂：酸-碱-酸（0.5mol/L HCl, 0.5mol/L NaOH） 阴离子交换剂：碱-酸-碱（0.5mol/L HCl, 0.5mol/L NaOH) 电泳：带电分子在电场的作用下，根据其所带电荷不同和分子本身的形状与大小不同，泳动的速率不同，从而得以分离。 等电聚焦：每一种蛋白质均有其特定的等电点，它们在具有pH梯度的电场下进行电泳时，当泳动到与其等电点相同的位置便停止泳动，从而得以分离。,29,4.根据酶分子专一性结合的方法,亲和层析：利用酶分子独有的专一性结合位点或结构性质的分离方法。 特点：分离效率高、速率快。 亲和配体：酶的底物、抑制制、辅因子、变构因子、特异性抗体等。 亲和介质应具备的条件： *非特异性吸附要尽可能小 *高度亲水性，不引起酶蛋白的变性失活 *化学和机械性能稳定 *具有高效的多孔结构，比表面积大 *具有大量可被活化偶联的基团，能与手臂结合 *配接的手臂长度合适，手臂与配体结合，而不 与酶蛋白非特异性结合。,30,免疫吸附层析：抗原-抗体的高专一性应用于酶的纯化过程。利用酶的单克隆抗体来亲和特异性的酶。 淋巴细胞产生抗体，但在体外培养条件下生存时间短，骨髓瘤细胞在体外生存时间长，但不产生抗体。将这两类细胞融合得到的杂交细胞兼有这两者的长处。所以将需要纯化的某一酶液作为抗原去免疫动物，然后分离动物的脾淋巴细胞，与遗传缺陷型骨髓瘤细胞相融合。经多次克隆后，挑选出能单一分泌这种酶抗体的杂交瘤细胞，再经扩大培养，得到这种酶大量的单克隆抗体。如用此技术从牛脑中提取L-芳香族氨基酸脱羧酶、重组人-干扰素等。,31,染料配体亲和层析：Cibacron蓝F3G-A染料与NAD+的构象相似，可与脱氢酶的NAD+结合部位相结合。染料非常容易通过三嗪基基团与琼脂糖介质偶联。蛋白质也容易洗脱下来。,Cibacron蓝F3G-A,Procion红HE-3B,32,共价层析：层析介质与被纯化的酶共价结合来进行分离。多用于可与之形成二硫键的巯基酶的纯化。被分离物共价结合到层析介质上,如巯基通过自由巯基与二硫键互换反应选择性地吸附在活化的巯基化的介质上。可用能够还原二硫键的低分子巯基化合物（如，L-半胱氨酸、巯基乙醇、谷胱甘肽和二硫苏糖醇）进行洗脱。,吸附,洗脱,再生,GST tagHis tag: Ni-NTA 亲和层析,33,(二）酶纯化的注意事项,建立一个可靠和快速的酶活性测定方法 在纯化过程中需要大量时间检测不同纯化阶段的酶活性。所以要求检测方法快速、简捷、灵敏、专一和准确。快速比准确更重要。如用5分钟可以检测出酶活性方法的准确性的误差为5%，比用30分钟检测的误差为0.5%好。因为前者可以缩短纯化时间，大大地减少酶失活的可能性。 一个好的检测活性方法的建立,就是整个纯化工作成功的一半。2.酶环境：酶不仅是催化剂，而且也是活细胞中代谢机制的组成成分，试管中的环境与细胞内的环境是大不相同的，不能忽视这一差别可能对酶行为的影响。纯化过程可在很多方面影响酶的活性。如辅因子的去除、细胞结构成分（如脂膜）的去除等。如-羟丁酸脱氢酶反应需要加入脂类。,34,3.控制温度和时间：整个纯化过程均应在0C的条件下进行，且时间 不宜过长，最好在2-3天内完成；,5.避免酸、碱。酶溶液的pH不要低于5和高于9。加酸碱时要防止局部 浓度升高；,6.防止表面变性。转移、搅拌、加固体盐时应防止气泡。,7.有机溶剂应预冷后加入，防止酶的变性和产生溶解热。同时防止局 部浓度过高；,8.去垢剂有时虽可有助于酶的溶解，但有时难免发生酶变性；,9.酶的保存：冻融不失活的酶可以在低温冰箱中保存数月；在高盐浓 度稳定的酶可以悬浮于饱和硫酸铵中；真空冷冻干燥的酶粉易溶解， 并可在室温下保存；酶在提取和纯化的过程中不怕霉菌污染，但在 保存过程中应予以预防。,4.在纯化酶的过程中常加入一些酶的保护剂，如二硫苏糖醇或-巯基 乙醇等保护巯基酶；,（三）纯化过程的记录,（猪肝异柠檬酸脱氢酶的提纯过程）,过程,提取液总量（ml）,酶活性（U/ml）,总活性（）,蛋白含量（mg/ml),比活性（U/mg蛋白）,得率（）,纯度（倍数）,匀浆,7000,2.85,19950,35.5,0.08,(100),(1.0),氯仿抽提,5800,3.60,20880,19.4,0.187,100,2.34,37.5%-55%硫酸铵组分（透析）,1500,11.25,16875,21.4,0.525,84.5,6.56,DEAE纤维素洗脱液,2380,3.82,9090,1.0,3.82,45.5,47.7,磷酸钙吸附洗脱液,450,15.05,6772,0.9,16.7,34,209,凝胶过滤，异柠檬酸洗脱,52,98,5096,2.15,45.6,25.5,570,（四）酶纯度的评价酶纯化的目标是使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度。,一些常用的检验酶纯度的方法,方法 备 注超速离心 对检测少量杂质（10 405 1850010 400 188008.0 405 162407.0 405 99407.0 400 98906.8 400 9600,55,四、影响酶活性测定的技术因素,1样品的处理溶血：细胞中的酶释放入血，可影响血清酶的测定。如红细胞中乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）活性比血清分别高150、15、7倍。抗凝剂：有的抗凝剂是酶的抑制剂。如EDTA可抑制含Ca2+的淀粉酶和需Mg2+的肌酸激酶、磷酸酶和5-核苷酸酶。样品的稀释：影响酶的稳定性和降低样品内抑制剂或激活剂的浓度。,56,2缓冲液的选择 * 缓冲液的酸解离常数（pKa）值必须接近酶测定的pH,一般不要超过1个pH单位。* 酶的最适pH受缓冲液种类的影响。如脲酶在磷酸缓冲液中最适pH为7.3，柠檬酸缓冲液中为6.7，而在醋酸缓冲液中为6.3。* 缓冲液应对酶无抑制作用。* 缓冲液不应参加酶促反应。在酶促反应中不被破坏。* 缓冲液在可见光和紫外光下应没有吸收或只有极低的吸收。* 要注意缓冲液因稀释或温度变化时发生pH的改变。如磷酸缓冲液用水稀释10倍(0.5mol/l 0.05mol/l)，其pH降低0.3单位。Tris缓冲液在4 C 时pH为7.0，在37 C 时pH为5.9。,57,温度对Tris缓冲液pH的影响,温度每升高1C，pH约下降0.033单位,58,第三章 酶实验中的酶动力学,Kinetics of enzyme-catalyzed reactions,59,一、酶促反应的初速率,（一）概念 酶促反应刚刚开始时，没有影响反应的任何因素存在时的反应速率称为酶促反应的初速率（initial velocity）。,酶反应初速率的条件是：底物浓度高于酶的浓度。对于一个典型的酶促反应来说，酶的浓度一般在nmol/L水平，底物浓度比酶的浓度高56个数量级。这样，在反应进行不长时间（如反应开始60sec之内）时，底物的消耗很少，可以忽略不计。此时，产物浓度与时间的延长呈正比；反应速率与酶浓度呈正比。,60,引起反应速率下降的原因：底物浓度降低，不能将酶饱和；可逆反应出现，反应达到或接近平衡；产物抑制作用；酶变性失活，反应在25-37C环境下进行，保温可使酶逐渐变性；反应时间延长有时可使反应液的pH改变。,61,（二）酶促反应初速率检测,一级反应期所测得的反应速率不能代表酶的活力，只有0级反应所测得的反应速率才能真正代表酶 活力，此时的反应速率称为初速率。即反应刚刚开始时,没有任何影响因素对反应速率施加影响时的反应速率。初速率时底物浓度高，酶被底物饱和，反应达最大速率。反应速率与酶浓度呈正比关系，产物浓度与时间呈正比。,62,反应进程度与酶浓度的关系,结论：反应时间和所用酶的浓度成反比,63,（三）初速率与Km的关系,E + S,ES,E + P,k1,k2,k3,在稳态时，中间产物ES生成的速率与分解的速率相等。其反应速率为,V =,k3 ES,Km + S,=,VmS,Km + S,当S恒定不变时，v E。在实际工作中，只有S高到足以使酶饱和时，S才能认为是保持恒定的。根据Michaetis-Menten 方程式，提高底物浓度仅能使酶趋于饱和，而达不到完全的饱和。,64,E + S,ES,E + P,k1,k2,k3,V =,VmS,Km + S,一般实验室工作中，底物浓度不应低于10倍Km值。,65,（四）初速率与平衡常数,人们一般估计，S/E 100时，若S的变化不超过10%，初速率可以得到维持。底物消耗多少才改变反应的初速率，最终由其平衡常数来决定。,平衡常数Ke =,P,S, 反应进行到t时的比值Kt =,Pt,St,若反应 A + B + C,P + Q +，则,Kt =,P0 + XQ0+XR0+X,A0 XB0 XC0 X,66,若反应 A + B + C,P + Q +，则,Kt =,P0 + XQ0+XR0+X,A0 XB0 XC0 X,酵母己糖激酶催化：葡萄糖,ATP,葡糖 6-磷酸ADP,Kt =,P0 + XQ0+X,A0 XB0 X,=,0+0.10.050+0.1 0.05,已知，Ke = 4.9 103 (pH7.2),底物的初始浓度为0.1mmol/l,当5%的底物转,化为产物时：,0.1-0.10.050.1-0.10.05,= 2.8 103 Ke,例如，,乙酸激酶催化：乙酸ATP,乙酰磷酸ADP,已知，Ke =3.3 10 4 (pH7.4)，乙酸初浓度10mmol/l, ATP=1mmol/l,当底物消耗时，,Kt =,P0 + XQ0+X,A0 XB0 X,=,0+10.050+1 0.05,10-10.051-10.05,=2.6 10 4 Ke,67,（一）米氏方程式及推导,Vmax S v = Km + S,二、底物浓度对反应速率的影响,68,米氏方程式的推导,1925年，Briggs & Haldane，稳态理论 k1 k3 E + S ES E + P k2 k4当反应系统中ES复合物的生成速率和ES复合物的分解速率相等时，ES复合物浓度保持不变的反应状态称为稳态（steady state）。,69,k1 E + S ES E + P k4,（1）ES复合物生成速率： V1= k1 E游离S 游离+ k4 E游离P因为 P很小，可忽略不计 （P表示产物的浓度） E游离E- ES （E表示酶的总浓度） S游离S - ESP S （S表示底物的总浓度）所以 V1= k1 ( E - ES ) S 方程(1),70,（2）ES复合物分解速率： V2= k2 ES + k3 ES 方程(2)（3）因为在稳态下，V1 = V2 ， 所以 k1 ( E-ES ) S = k2ES + k3ES方程(3)移项，得 k1 E S E SES = 方程(4) k1S + (k2+k3) S + (k2+k3)/k1,k3 E + S ES E + P k2,71,k2+k3令 Km = Km 称为米氏常数 E S ES = 方程(5) S + Km,k1,72,（4）酶反应速率 v = k3 ES k3 E S = 方程(6) S + Km,73,（5）当底物浓度S很高时，所有的酶被底物饱和形成ES复合物，酶促反应达到最大速率 Vmax，此时 ES = E Vmax