耐药性产生机制与新药开发2011

1,兽药研发思路和注意问题,王丽平 教授动物医学院药理组,2,食品动物用药减少，宠物用药明显增加抗寄生虫药物增加，抗菌药物减少重视复方制剂和系列制剂的研发（1：5-7）大力开发非甾体抗炎药,一、国外兽药研发趋势和特点,3,二、国内兽药研发趋势和特点,基本上是食品动物用药抗微生物药占主体兽药剂型和制剂种类单一中兽药中西复方兽药品种繁多,4,以动物专用的抗菌药物和抗寄生虫药物为主导方向的原料药的研发；利用现代的基因工程等技术开发新型杂合抗生素；通过激活放线菌的沉默基因产生新的抗生素；改善原有抗生素的结构，开发新的半合成抗生素。,三、研发思路,5,反刍动物：抗寄生虫药的浇淋剂、大丸剂、控释剂；促生长药的埋植剂等奶牛：抗菌药乳房灌注剂（泌乳期和干乳期）、乳头清洁剂仔猪：抗菌药的乳膏剂（舐剂）、滴剂等宠物：抗寄生虫药的项圈、洗涤剂（香波）、咀嚼片等水产养殖：抗菌药和抗寄生虫药等的膨化剂等环境消毒：消毒药的喷雾剂等,新剂型、制剂：给药方便，适合群体给药，价格便宜,研发方向,6,加强水产养殖动物用药的研发,代谢性疾病和营养缺乏症的防治药物；调节鱼类生理功能的药物；诱食剂、保鲜剂和风味剂。 还要解决几个突出的问题：鱼类用药的剂型和加工工艺技术；通过饲料给药，但病鱼不吃饵料，如何给药？大面积泼洒用药，用药量太大，又污染、破坏环境水质，如何解决？,7,宠物用药基本与人相似，可以选择价格较昂贵的药物，剂型和制剂也可以考虑技术含量较高的产品，另外也不需要考虑药物残留的问题。宠物用药除了前述抗寄生虫药、抗微生物药外，非甾体抗炎药也是常用药物。,加强宠物用药的开发,8,欧盟1999年禁止4种抗生素（磷酸泰乐菌素、杆菌肽锌、螺旋霉素、维吉尼亚霉素）用作饲料添加剂后，又决定从2006年1月1日起禁止所有抗生素用作饲料添加剂。目前较多研究的饲料药物添加剂主要有如下几类：抗菌肽；微生态制剂；酶制剂；寡聚糖类；酸化剂； 中草药添加剂；代谢调节剂；生长激素等。,加强饲料药物的开发,9,仿制时避免专利侵权，避免重复研制研发企业应注重药物的安全性，尤其是新中兽药制剂的基础药理学如药代动力学、毒理学和残留消除的研究。注意生物制剂的安全性和有效性。明确复方制剂的组方依据长效、缓释制剂应注意避免细菌、虫株耐药性产生及残留避免对生态环境的影响,四、研发注意问题,耐药性产生机制与新药研发,王丽平 教授动物医学院药理组,2000 甘氨酰四环素,2003 脂肽类,1999 噁唑烷酮,1962喹诺酮类,1962 链阳菌素,1958 糖肽类,1936 磺胺类,1950 氨基糖苷类,1949 氯霉素,1949 四环素,1940 -内酰胺类,1930,1940,1950,1960,1970,1980,1990,2000,抗菌药的发展简史,1952 大环内酯类,一、抗菌药与耐药性的发展简史,抗菌药应用与耐药性发展,一般临床应用3-12年后开始出现耐药性,有的应用之初即出现耐药菌,二、抗菌药物在动物上使用的潜在后果,抗菌药物,预防畜禽疾病,治疗畜禽疾病,促进畜禽生长，提高饲料效率,抗菌药在畜禽养殖上的应用,抗菌药物在动物上使用的潜在后果,耐药菌株耐药基因在细菌之间的传播耐药菌株传染人食物链与动物的直接接触抗菌药物残留人体肠道菌耐药性引起人和动物疾病治疗的失败,耐药菌株从动物传染人,有关抗菌药用于动物后使动物源病原菌产生耐药性并转移到人体的直接或间接证据较多目前能支持动物传给人的耐药菌引起人感染性疾病发生升高、病情加重和死亡率增加的证据很少,Salmonella & E. coliFluroquinolones3rd CephalosporinsAminoglycosidesSulphonamidesCampylobacterFluroquinolonesMacrolides,Enterococci,Streptococci,StaphylococciVancomycinStreptogramins,对人类健康和公共卫生构成威胁的动物源耐药菌,G-的耐药性大都与食品动物治疗性药物有关,G+的耐药性大都与食品动物促生长添加剂有关,The New England Journal of Medicine, 341(19), pp. 1420-1425.,丹麦1998年爆发一起FQs耐药沙门氏菌DT104感染，源自猪，通过食物传播,Fey等2000年报道了美国western Nebraska一例由牛传给儿童的头孢曲松耐药沙门氏菌DT104感染的病例。这是首次报道家庭获得耐药菌。,N Engl J Med. 2000 Apr 27;342(17):1242-9,1998年3月，病人的父亲治疗了自己和其他3个农场几头有严重腹泻的牛，其中有几头牛死亡了,牛粪便分离到鼠伤寒沙门氏菌,病人于4月发病，腹痛、高烧入院治疗,病人粪便分离到鼠伤寒沙门氏菌,人源菌和一株牛源菌均耐头孢曲松和头孢噻呋，并检测到位于质粒上的CMY-2,牛源,人,产ESBLs 或AmpC酶沙门氏菌和大肠杆菌,高耐氨基糖苷类药物的肠球菌通过食物链从动物到人,人,鸡肉,人,猪肉,耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）从宠物到人,Manian(2003)采用PFGE方法发现一糖尿病人和他妻子伤口感染的MRSA与从他们家的犬分离的MRSA是同一株菌，成功地除去犬鼻孔上的MRSA后，夫妻俩的MRSA也消除了并停止了反复感染。,犬,主人,宠物与人亲密接触,各国动物细菌耐药性监测系统,1995年，丹麦成立DANMAP1996年，美国建立NARMS1996年，西班牙建立VAV1999年，日本建立 JVARM2000年，挪威 建立NORM-VET2000年，瑞典 建立SVARM2001年，匈牙利2002年，加拿大建立CIPARS 2002年，新西兰 建立MARAN2003年，意大利成立ITAVARM,美国耐药性监测系统 NARMS,/cvm/narms-pg.html,25,1996年，Salmonella enterica serotype Typhimurium Definitive Type 104 (DT104)多药耐药菌的出现促使美国FDA建立了国家抗菌药物耐药性监测系统(NARMS)。,DT104染色体上携带对氨苄西林、氯霉素、链霉素、磺胺和四环素耐药的基因，并对喹诺酮类和甲氧苄啶都失去了敏感性。该菌种目前正在欧洲大多数国家、美国的人和动物群体中流行,US NewsNov 24, 1997,NARMS 1996年建立Food and Drug Administrations Center for Veterinary Medicine (FDA CVM) U.S. Department of Agriculture (USDA) Centers for Disease Control and Prevention (CDC),耐药性监测菌来源：人和动物临床分离菌健康动物来源菌生的动物性食品零售肉制品菌种： non-typhoid Salmonella Campylobacter E. coli Enterococci,28,三、细菌耐药性产生的主要机制,固有耐药(intrinsic resistance) 基于药物作用机制的一种内在的的耐药性，又称天然耐药，由细菌染色体基因决定，代代相传。 如: 肠道阴性杆菌 - 青霉素 绿 脓 杆 菌 - 氨苄西林 获得性耐药(acquired resistance) 不具有固有耐药，耐药基因是后天获得的,细菌获得性耐药的来源,基因突变(mutation)：如氟喹诺酮类耐药可移动因子(Mobile elements)：如四环素耐药基 因tet来源于链霉菌和分支杆菌。质粒（plasmid）转座子(transposon)基因盒(integron-cassette),在抗菌药选择性压力下细菌发生基因突变,质粒 plasmid,质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子。接合性质粒（conjugative plasmid）：能通过细菌间以接合方式转移。包括两部分：耐药决定因子，具有一个至数个耐药基因，使细菌对抗生素产生耐药性。耐药转移因子(RTF )，负责耐药因子转移时所需物质的制备和合成，还与质粒DNA的复制、接合过程中耐药基因的转移等有关。最主要者为性纤毛(sex pili) 。非接合性质粒（nonconjugative plasmid)：仅有耐药决定因子而无耐药转移因子，不能通过细菌接合转移，而系通过转化、转导或由接合型质粒“诱动”（mobilization）等方式转移。,33,转座子 transposon,转座子是可从细菌基因组一个位点移至另一个位点的DNA序列。易位（translocation）或转座（transposition）：即耐药基因可自一个质粒转座到另一个质粒，从质粒到染色体或从染色体到噬菌体等。可转座的遗传片段有两种，即转座子和插入顺序（IS）。两者在各自的两侧均带有反向重复序列(IR)，并且各自均可作为独立的单位参与转座过程。转座酶基因在两个IR之间，转座酶识别IR序列。,34,整合子/基因盒系统 integron/ cassette,整合子是基因捕获和表达系统。由3个主要部分构成：一个编码整合酶的基因(intI)、一个初级重组位点(attI)一个高效增强子(Pc)整合酶介导在初级重组位点(attI位)和次级重组位点(attC位，59-bp)的序列的重组。基因盒：一个attC位与一个开放阅读框(ORFs)连在一起结构上称为基因盒，为整合子的可动部分。基因盒插入的attI位，位于增强子的下游。 attC参与基因盒的移动。基因盒本身不含启动子，Pc驱动基因盒编码蛋白质的表达。,35,基因盒移动示意图,1. 转化（Transformation） Uptake of “naked” DNA2. 接合（Conjugation） Plasmid transfer Conjugative transposons3. 转导（ Transduction） phage delivers DNA to cell,1,2,3,耐药性的水平转移方式,转 化,耐药菌溶解后释出的DNA进入敏感菌体内，其耐药基因与敏感菌中的同种基因发生重组，使敏感菌成为耐药。,接 合,通过耐药菌和敏感菌菌体的直接接触，由耐药菌将耐药因子转移给敏感菌，可发生在不同种细菌间，可同时转移多种耐药基因，最常见的方式。,转 导,耐药菌通过噬菌体将耐药基因转移给敏感菌，转导是金葡菌中耐药性转移的唯一方式。,细菌耐药的生化机制,产生灭活酶：改变抗生素结构，使其灭活。 靶位改变：抗菌药作用的靶位（如核糖体和核蛋白）由于发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗菌药作用的靶酶（如PBP和DNA促旋酶）的结构发生改变使之与抗菌药的亲和力下降。降低抗菌药物在菌体内的积聚：改变外膜通透性，减少抗菌药物进入菌体。增强外流(efflux)，使进入菌体内的抗菌药物，迅速外流。细菌生物被膜（biofilm）的形成使抗菌药物无法进人胞内。,细菌耐药机制示意图,各类抗菌药物的耐药机制,-内酰胺类药物-内酰胺酶：破坏 -内酰胺环，为耐药主要机制。 革兰氏阴性菌靶位改变：PBP数量改变或缺失；与抗生素亲和力下降；产生缓慢结合的PBP；诱导性PBP出现。 革兰氏阳性菌外排泵 MexA,BOprM，铜绿假单胞菌,ESBLs,ESBLs是指能够广泛水解青霉素类、第一、二、三代头孢菌素以及单环-内酰胺类抗生素（氨曲南），并可被克拉维酸等酶抑制剂所抑制的一类-内酰胺酶。ESBLs 主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌产生，由质粒介导，往往由普通的-内酰胺酶基因 （TEM-1, TEM-2，SHV-1）突变而来主要有CTX-M型ESBLs和CMY-2型AmpC酶，国内主要有CTX-M型ESBLs和CMY-2型AmpC酶。产ESBLs 细菌在体外药敏试验中对第三代头孢菌素和氨曲南的抑菌环缩小，但并不一定在耐药范围，加入克拉维酸可使其抑菌环扩大。,氨基糖苷类钝化酶乙酰转移酶（AAC），使游离氨基乙酰化；磷酸转移酶（APH），使游离羟基磷酸化；核苷酸转移酶（AAD）或腺苷酸转移酶（ANT） 药物摄入减少靶位改变（16S rRNA甲基化酶）,45,16S rRNA甲基化酶,介导对多种氨基糖苷类高水平耐药 （MIC1024g/mL ），包括庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、西梭米星、萘替米星、阿贝卡星等； 机制：甲基化16S rRNA A位点的碱基，使氨基糖苷类不能与其作用靶点相接合；基因型较多，包括rmtA、rmtB、rmtC、rmtD 、npmA和armA；位于质粒和转座子上，具有易于传播和扩散的特点;已从多个国家和地区及多种革兰氏阴性杆菌中检测到;,1.染色体介导耐药靶位改变：DNA旋转酶改变药物摄入减少：主动外排和膜孔蛋白缺失，NorA、NorM2.质粒介导的耐药机制（PMQR） Qnr蛋白：质粒介导，与DNA促旋酶和拓扑异构酶 DNA 结 合，保护酶不被喹诺酮类抑制 氨基糖苷乙酰转移酶的变异蛋白（AAC(6) -Ib-cr）：质粒 介导，乙酰化含有哌嗪环的环丙沙星和诺氟沙星,灭活药物。 QepA外排泵：quinolone efflux pump,三者的作用点不同,可独立出现、分别作用，也可共存于同一质粒上、 共同参与耐药。,氟喹诺酮类,48,1987年曾报道在痢疾志贺菌中发现质粒介导的喹诺酮耐药 ,但是一直未得到确认 。1998年美国研究者在临床尿液标本中分离的一株多重耐药的肺炎克雷伯菌中发现一个大小为56Kb 的质粒 PMG252中存在qnr ,这是关于质粒介导的喹诺酮耐药的首次报道。qnr基因包括qnrA，B，C和S。qnr的遗传背景：位于质粒或整合子（尤其是I型）qnr基因一般介导较低水平的喹诺酮耐药 ,但可协同其它耐药机制而导致较高水平的耐药 同时基因也可促进细菌染色体基因自发突变的发生 ,增加高水平耐药株出现的可能性。,Qnr蛋白,49,aac (6)-Ib 型氨基糖苷转移酶基因最早报道于 1986 年 ,目前发现的有近 30 种相似的基因，主要介导细菌对氨基糖苷类药物耐药。 aac (6)-Ib-cr 5端多了12个独特的碱基对，同时点突变使其编码蛋白的 2 个氨基酸变异(102 位 Trp Arg ,179 位Asp Tyr) 。aac (6)-Ib-cr仅对环丙沙星、诺氟沙星有效 ,而对左氧氟沙星、 莫西沙星等不起作用（氨基被甲基取代）。aac (6)-Ib-cr是通过对喹诺酮类药物哌嗪环上氨基氮原子的乙酰化作用而介导低水平耐药，但并不参与氨基甙类抗生素庆大霉素的耐药。,氨基糖苷乙酰转移酶的变异蛋白（AAC(6) -Ib-cr）,50,QepA,2007年法国学者报道。qepA 由 1 536 bp 核苷酸构成 ,拥有较高的 G + C 含量(72 %) ,编码蛋白 QepA 由 511 个氨基酸构成 ,为质子依赖型外排蛋白 ,由 14 个跨膜片段( TMS)组成 ,属于主要易化超家族（MFS）。目前对 qepA 的分布报道较少 ,比利时、日本、法国和中国都有相关报道。qepA 在人和动物来源的菌株中均有存在 ，人很可能通过食物链获得此种耐药机制。QepA 通过对亲水性喹诺酮类药物的外排而介导低水平的耐药。,大环内酯类抗生素活性分子被钝化大环内脂类抗生素钝化酶：红霉素酯酶（ereA,ereB）。林可霉素钝化酶：linA和linA基因。抗生素作用靶位发生变异（核糖体50S亚基改变）23S rRNA 发生改变：23S rRNA甲基化酶由红霉素核糖体甲基化基因erm编码，使23S rRNA甲基化。核蛋白发生改变：L22和L4基因发生突变。23S rRNA 发生突变主动外排：mef、msr基因介导,四环素类药物外流加快，在细菌体内积蓄减少：由编码外排基因的质粒或转座子引起，tetA-E(G-), tetK和tetL（G+）；核糖体30S亚基改变：由编码核糖体保护蛋白(RPPs) 的基因tetM 和tetO 表达引起，位于质粒或转座子上。灭活或钝化四环素的酶：tet（X）,酰胺醇类灭活酶：乙酰转移酶Cat泵出机制：cmlA：氯霉素， cmlA蛋白与四环素耐药泵出蛋白有一定水平的相似性。cmlA蛋白位于细菌内膜，并通过主动泵出使氯霉素在菌体内的含量明显减少从而实现细菌耐药。floR：氟苯尼考/氯霉素，阴性杆菌fexA：氟苯尼考/氯霉素，阳性球菌靶位改变：23S rRNA甲基化酶,54,四、应对兽用抗菌药耐药性对策的思考,建立全国动物源细菌耐药性监测系统，成立专门机构或专门立项，开展动物源抗菌药物耐药性全面、系统的监测工作掌握我国目前抗菌药物耐药性的流行情况 评估现有抗菌药的耐药性和安全性提出抗菌药禁用清单为相关机构制定抗菌药管理的政策和措施及临床合理使用抗菌药物提供依据,研究合理用药方案，减少耐药性的发生用PK/PD模型研究给药方案研究抗菌药物的防突变浓度,优化给药方案，减少耐药性产生,研发抗耐药菌新药通过微生物基因组学的研究,筛选具有新作用机制的新抗菌药，如细菌-宿主细胞表面黏附作为新的分子作用靶位，例如合成小分子的寡糖类，可与细菌表面的粘附素或植物血凝素结合，使细菌的毒力减低。研制对酶的灭活作用稳定、不能为细菌外排泵识别、或封闭耐药靶位的抗菌药,探索控制与清除耐药性基因的物质：应用基因工程技术，探索直接破坏编码细菌耐药性的耐药基因的药物寻找增强与保护抗菌药物性能和探索提高机体防御功能与减少微生物病原性的物质,研发促生长抗菌药物的替代品益生素（probiotics）酶制剂（enzymes）寡糖（oligosaccharides）矿物质（minerals）中药（herbs）酸化剂（acidification）新型抗菌肽（novel peptides）免疫增强剂（immunopotentiators）,规范管理动物抗菌药物使用实施规范化管理（ GLP，GMP，GCP，GSP ）提出合理使用抗菌药的规程从加强动物饲养管理着手，减少疾病的发生，使用疫苗控制对从业人员（养殖人员、技术人员、兽药销售人员、管理人员）加强合理用药的宣传和培训工作，了解耐药性的严重性和危害性,61,通过执行良好农业规范（GAP），从饲养管理方面减少抗菌药物的使用量，从而减少耐药菌的出现；通过执行良好食品卫生规范（GHP）和危害分析关键控制点（HACCP），减少耐药菌在食物链的流通，从而降低人体接触耐药菌的几率。,重视细菌耐药性与公共卫生的关系,62,五、阻断细菌耐药，开发新药,63,针对-内酰胺酶，已研制用于临床的一系列有效的酶抑制剂克拉维酸（棒酸，clavulanic acid） 阿莫西林克拉维酸（奥格门汀） 替卡西林克拉维酸（泰门汀） 舒巴坦（青霉烷砜，sulbactam） 氨苄西林舒巴坦（优立新）他唑巴坦（tazobactam） 哌拉西林他唑巴坦（Zosyn）,64,通过实验发现石芽茶、大蒜、大黄、谷精籽、黄柏、黄芩等中草药提取液对-内酰胺酶也有不同程度的抑制作用，这为我国传统中草药的深度开发应用探索了一条新的途径。,65,-内酰胺类抗生素头孢喹诺（Cefquinome）：Hoechst研发，1993年上市。用于治疗牛猪呼吸系统疾病和乳腺炎。泌乳期奶牛限用。头孢维星（cefovecin）：Pfizer公司研制，2006年上市，主治犬猫皮肤、软组织、和泌尿道感染。头孢赛曲（Cephatril）：Boehringer Ingelheim 公司产品, 抗菌药物, 商品名Ubrocef。1999年在西班牙上市, 用于奶牛腺乳炎的治疗。,改善作用的新型兽用抗生素,66,泰拉霉素(Tulathromycin)：Pfizer公司产品, 大环内酯类抗生素,注射剂，商品名Draxxin。2004 年在欧洲上市，2005 年在美国上市。用于治疗猪、牛的呼吸道感染, 如猪的放线杆菌性胸膜肺炎、巴氏杆菌病、波氏杆菌、副嗜血杆菌病，牛的巴氏杆菌病、睡眠嗜血杆菌病。,大环内酯类抗生素,67,吡利霉素(pirilmycin）：普强公司创制的林可霉素类抗菌药物，1993年获准在美国上市，商品名为Pisue，剂型为凝胶剂。本品对金萄球菌、无乳球菌、停乳链球菌、乳房链球菌所致的临床及亚临床型乳腺炎效果明显，是治疗乳腺炎尤其是泌乳期乳腺炎的良好药物。,林可胺类抗生素,68,截短侧耳素衍生物,沃尼妙林（Valnemulin）：畜禽专用抗生素，Novartis公司产品, 1999年首次在英国上市，属抗菌性饲料添加药物，也是全欧州批准的第一个兽药预混剂。国外已批准用于牛、猪、鸡等动物由敏感菌引起的疾病，特别是畜禽呼吸道感染。沃尼妙林作用略强于泰妙菌素。,69,利奈唑胺(linezolid) 为新的化学结构噁唑烷酮类(oxazolidinone)，国外已上市，对革兰氏阳性菌有强大作用，如MSSA、 MRSA、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、粪肠球菌及屎肠球菌(包括VRE)、链球菌属，青霉素敏感及耐药肺炎链球菌等；对厌氧菌包括部分脆弱拟杆菌、诺卡菌属、结核分枝杆菌及其他分枝杆菌亦有良好作用。 作