基因诊断与基因治疗

基 因 诊 断 与基 因 治 疗,基因诊断的概念,基因是遗传学上的一个概念，是在染色体上占有一定的位置，表现一定功能的基本单位基因的物质基础是脱氧核糖核酸（DNA）（有些病毒的基因是核糖核酸，RNA）基因诊断是指运用现代分子生物学和分子遗传学方法检查基因的结构及其表达产物，是目前诊断技术中最具发展前途的技术。,基因诊断的分子生物学基础,基因诊断操作的对象为基因或其片段运用现代分子生物学和分子遗传学方法，检查特定基因的存在与否、基因的结构及其表达功能是否正常等，从而确定：是否患有某种遗传病：成年人遗传型分析，产前诊断是否患有某些特定的微生物感染疾病是否患有某种肿瘤，对肿瘤病人的预后进行分析基因配型，用于移植、输血等法医学上，分析犯罪现场的证实与嫌犯的鉴别,基因诊断的途径,检查是否存在特定的DNA或RNA，用于微生物感染的诊断基因突变的检测限制性内切酶酶谱分析等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法基因连锁分析限制性片段长度多态性分析(RFLP)基因的单碱基多态性分析(SNP)基因转录产物mRNA检测基因型的鉴定与比较,基因诊断的对象,1、病原生物的侵入：一般侵入体内的病原生物可通过显微镜检查各免疫学方法进行诊断。直接检测病原生物的遗传物质提高诊断的敏感性2、先天遗传性疾患：已有多种传统的遗传性疾患的发病原因被确定为特定基因的突变。例如：苯丙氨酸羟化酶基因突变可引起苯丙酮尿症：腺苷脱胺酶基因突变可引起重症联合免疫缺陷症（SCID)；而淋巴细胞表面分子CD40或其配体（CD40L）基因突变则可引起无丙种球蛋白血症。用基因诊断的方法检测其基因突变利于确诊和治疗方案的建立3、后天基因突变引起的疾病：肿瘤。肿瘤的发生是由于个别细胞基因突变而引起的细胞无限增殖。基因诊断可确定抑癌基因发生突变还是癌基因发生突变4、其它：如DNA指纹、个体识别，亲子关系识别，法医物证等,基因诊断的运用,一是通过检测特定基因或相关疾病基因的存在以判断和评估某疾病在某一个体上发生某疾病的风险，以导向预防这种疾病的发生二是通过基因诊断促使个性化药物的诞生三是通过基因诊断更精确判断某些传染性疾病或肿瘤等疾病的存在，以有利于临床医生尽早确定病因基因诊断技术不仅在疾病检测上具有重要意义，而且在婚前检查，亲子鉴定等人类生活方面具备广阔运用前景,基因诊断的方法,PCR核酸杂交基因芯片(chip)扩增片段长度多态性(Amp-FLP) 等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法(ASO) 单链构象多态性诊断法 (SSCP),PCR技术的发明及特点,1985年Saiki 首次用以扩增珠蛋白基因标志PCR技术的问世。PCR技术具有简便、快速、特异和灵敏等特点，它用于基因诊断，使之发生了革命性的变化。PCR技术可使待测样品中的目的基因片段在几小时内，甚至十几秒内扩增百万倍，如果标本中原来的目的基因达到fg级水平，就可以通过简单电泳和溴化乙啶(EB)显示扩增后的核酸片段区带。从检测区带的电泳位置看它是否符合引物设计的扩增长度。,PCR技术的进展,PCR-Southern印迹 模板检测灵敏度可达ag级水平(可查出几个病毒的存在)则能看到杂交带。特点：特异性强，但操作费时间，一次需3d，这使急于根据检测结果决定治疗措施的临床医生迫不及待。套式PCR 是指在用第一对引物(外引物)扩增之后，加入另一对位于外引物内侧的内引物，再行扩增数十个循环，这可将标志检测时间压缩8-10h，第2日便可获得高敏感性的检查结果。其敏感性大致与PCR-Southern印迹相当。,PCR的微量化 反应体积减少至10-20l，降低了PCR检测的成本。在1次PCR中加入多对引物，可用于病毒、细菌等的分型和多种病原体基因的检测。PCR扩增产物，用专为检测双链DNA而设计的微量荧光计定量，就可从标准模板DNA的量或拷贝数达到PCR定量的目的。取样技术的改进 对于产前诊断，初期是取羊水细胞，需进行细胞培养。从1982年起采取妊娠8-12周的绒毛DNA作产前诊断使产前基因诊断的时间提前。由于PCR技术的应用，甚至在胚胎植入前(受精6d)也可作产前诊断。,反向遗传学策略 过去寻找致病基因是从经典遗传学思路出发，先发现疾病的表现改变，再经过不同方法由表型追溯到基因。近几年来发展起来的“反向遗传学”(reverse genetics)在策略上解决了经典遗传学所不能解决的这个难题。在不知道和不必知道基因产物或表型的情况下分离和定位致病基因，并由它的一级结构推出产物的氨基酸序列。方法：须先采用细胞遗传学方式或RFLP连锁分析确定致病基因在染色体上的大概位置，然后采用染色体步移（chromosome walking）或染色体跳跃（chromosome hopping）技术逐渐接近，最后找到的基因的准确位置。成功例子：如Duchenne肌营养不良和囊性纤维变等致病基因的发现；预计亨廷顿舞蹈病、神经纤维瘤、多发性肠息肉和成人型多囊肾等疾病的致病基因，不久可望用此策略得以确定。,核酸杂交概念,不同来源的DNA加热变性后，只要两条多核苷酸链的碱基有一定数量能彼此互补，就可以经退火处理复性现象，形成新的杂交体双螺旋结构，这种依据相应碱基配对而使不完全互补的两条链相互结合称为分子杂交。,核酸杂交分类,基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类DNA探针还有单链和双链之分,核酸探针的标记和检测,核酸探针的常用酶促标记技术缺口平移DNA快速末端标记用T4多核苷酸酶标记DNA 5末端，随引物延伸聚合酶链反应核酸探针的非放射性标记技术光促生物素标记核酸酶促生物素标记核酸寡核苷酸的生物素末端标记酶标DNA酶标寡核苷酸DNA半抗原标记,核酸分子杂交方法,核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。,基因芯片概念,也叫DNA芯片，是在90年代中期发展出来的高科技产物。基因芯片大小如指甲盖一般，其基质一般是经过处理后的玻璃片。每个芯片的基面上都可划分出数万至数百万个小区。在指定的小区内，可固定大量具有特定功能、长约20个碱基序列的分子探针。,基因芯片的原理及用途,原理：由于被固定的分子探针在基质上形成不同的探针阵列，利用分子杂交及平行处理原理，基因芯片可对遗传物质进行分子检测可用于进行基因研究、法医鉴定、疾病检测和药物筛选等特点：基因芯片技术具有无可比拟的高效、快速和多参量特点，是在传统的生物技术如检测、杂交、分型和DNA测序技术等方面的一次重大创新和飞跃,基因芯片应用,基因破译 ：基因功能；提高测序速度基因诊断 ：癌症、糖尿病等，借助一小滴测试液，医生们能预测药物对病人的功效，可诊断出药物在治疗过程中的不良反应，还能当场鉴别出病人受到了何种细菌、病毒或其他微生物的感染。,扩增片段长度多态性,概念：小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）连锁分析法。方法：PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析。,等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法,当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide, ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。PCR可结合ASO，即PCRASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。,单链构象多态性诊断法,单链构象多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或突变的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据此作出诊断。PCRSSCP法具有能快速、灵敏地检测有无点突变或多态性的优点，但如欲阐明突变的碱基性质，则需作序列分析。,基因诊断的质量控制,特异性：杂交技术是通过基因克隆制备探针来完成，PCR是通过引物来完成，RFLP是利用限制内切酶来完成等。即探针、引物、限制性内切酶在反应中都具有特异性。灵敏度：杂交技术用同位素或酶标记探针，PCR反复扩增20-30次都是提高灵敏度的手段。二次PCR、PCR与Southern blot合用都是典型的例子。操作简单：杂交技术因操作复杂且费时（需1-2天以上出结果），在临床实验室难以推广。而PCR方法相对简单、快速，故推广迅速。实验成本：分子生物学实验因试剂多数依赖进口，成本高，给临床推广造成一定困难。试剂国产化是今后的努力方向。重复性和稳定性,基因诊断的应用,感染性疾病病毒性疾病的诊断：HBV、HCV、HIV和HPV细菌性疾病的诊断：TB、疟原虫遗传性疾病镰刀状细胞贫血症：beta-珠蛋白基因AT变换甲型血友病：凝血因子VIII肿瘤 ras癌基因突变、c-myc癌基因 p53抑癌基因、p16抑癌基因产前诊断、移植配型法医鉴定,基因诊断的意义,一是可以解决遗传性疾病难以诊断的黑洞，由于遗传性疾病主要是由特定的DNA序列即基因决定的，通过基因诊断能够在遗传病患者还未发现出任何症状之前就能确诊二是肝炎、癌症、艾滋病都与病毒有关，而通过基因诊断技术就可以顺利检查出隐藏在人体细胞基因中的病毒从而在造成危害之前消灭它们。,基因治疗 (Gene Therapy)的概念,人类疾病的发生，是人体细胞中自身基因的改变，是由外源病原体的基因产物与人体基因相互作用的结果。因此，长期以来，科学家设想人类能否最终运用遗传物质，无论是人类自身的或是外源遗传物质来治疗疾病，纠正人体本身基因结构或功能上的错乱，阻止病菌的 ，杀灭病变的细胞或抑制外源病原体遗传物质的复制，保证人体健康。基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因较正或置换致病基因的一种治疗方法。目的基因被导入到靶细胞（target cells）内，他们或与宿主细胞（host cell）染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。目前基因治疗的概念有了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。,基因治疗的潜力,基因治疗的历史沿革 1990年，科学家第一次用反转录病毒为载体，把腺苷脱氨酶基因（ADA）导入来自病人自身的T淋巴细胞，经扩增后输回患者体内，获得可成功。标志着基因治疗时代的开始。 1995年美国FDA批准AdP53肿瘤基因治疗等临床试验的实施，标志着基因治疗已逐步进入一个正常的、目标明确的理性化发展阶段。,18岁的格尔辛基（Jesse Gelsinger）因临床试验的某些失误而于1999年9月17日死亡。格尔辛基是世界上首位由基因治疗导致丧生的患者。他患先天性鸟氨酸甲酰氨基转移酶（OTC）缺乏症（X连锁性遗传病）病症，在男性身上较严重，往往引起新生男婴患者的死亡。2006年7月24日,来自伊利诺斯州的一名36岁女患者，为了治疗自己的风湿性关节炎而采用基因治疗的方法,在一条腿的膝盖部位注射了药剂结果死亡,该公司也被迫关闭。,基因治疗的前景分析基因治疗是将具有治疗价值的基因，即“治疗基因”装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载体中，导入人体细胞，直接进行表达。进行基因治疗时毋须对表达产物进行分离纯化，因为人细胞本身可以完成这个过程。,可大大降低治疗成本。因为基因治疗不需要基因工程中耗资最大的器材与材料费用，显著降低了工业化的成本。基因工程的“目的基因” 往往不能有效地进入细胞而不能备应用于基因工程。但基因治疗不受上述限制。具有治疗作用，理论上均可应用于基因治疗。因此，基因治疗具有更大的潜力。,基因治疗则必须将基因直接导入人体细胞，不仅在技术上具有很大难度，而且在有效性于安全性方面提出了风为苛刻的要求。基因治疗仅有10年的历史，不少技术还不够成熟。所以，它所遇到的风险性更大。,基因治疗的策略,基因置换（gene replacement）：基因置换就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。基因修复（gene correction）：基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实践中有一定难度。,基因修饰（gene augmentation）又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成基因失活（gene inactivation）：利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，已达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。,免疫调节（immune adjustment）：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素-2导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。其它：增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性：采用给予前体药物的方法减少化疗药物对正常细胞的损害。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予病人无毒性GCV药物，由于只有含HSV-TK基因的细胞才能将CGV转化成有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。耐药基因治疗：将产生抗药物毒性基因如MDR-1导入干细胞中，使机体耐受更大剂量的化疗或放疗,遗传性疾病基因治疗策略,隐性遗传病 用正常基因置换致病基因而达到完全校正导入正常基因序列以达到暂时性校正显性遗传病用正常基因置换致病基因而达到完全校正使有害基因失活而达到暂时性校正（如用反义技术、核酶等）在某些情况下可导入正常基因加以校正（如LDL受体）,低密度脂蛋白受体,疾病基因治疗策略,肿瘤杀伤肿瘤细胞：利用自杀基因，激活免疫系统及保护正常细胞免受化疗药物的损伤等使癌基因失活（反义技术、核酶）增加抑癌基因的表达传染病杀伤传染源（免疫法、自杀基因） 使传染源失活（反义技术、核酶、核酸陷井）其它疾病导入药物基因（药物释放）如激素、细胞因子失活、有害基因产物（反义技术、核酶、核酸陷阱）杀伤策略如减少特异细胞群,体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)的途径Ex vivo cells removed from body, incubated with vector and gene-engineered cells returned to body.In situ vector is placed directly into the affected tissues.In vivo vector injected directly into the blood stream.,咨询,体细胞,半乳糖血症,饮食的,苯丙酮尿症,抗疟疾药物,甲状腺素,甲状腺低能症,苯甲酸酯,降胆固醇药,吡哆醇,高胱氨酸尿,脱氨酶,戈谢病,葡萄糖脑苷脂病,炎症或肉芽肿性,地中海贫血,基因治疗的障碍1. 基因治疗载体的建立2. 治疗基因的构建3. 受体细胞的增殖与维持有效的基因转移技术使DNA进入受体细胞核内并整合到染色体基因组中4. 经基因转移后的治疗用细胞的增殖和向病人的移植,治疗基因在细胞内的命运,实验室基因治疗研究,疾病的遗传背景及机制的揭示可选治疗基因的筛选及评价基因治疗药物的制备治疗用目的基因基因转移及表达载体接受基因转移的细胞基因转移的方法途径的选择基因治疗效果的评估基因治疗药物的安全性评估,临床人体基因治疗的基本程序,疾病的评估目的基因的选择和制备基因的转运载体基因治疗药物的制备受体靶细胞的选择细胞转染(transfection)或感染(Infection)外源基因的表达及检测基因治疗的疗效评价基因治疗的安全性及伦理学,基因治疗所应用的治疗基因,基因治疗的载体系统,RNA病毒载体(反转录病毒)RNA viruses (Retroviruses)1. 鼠白血病病毒 Murine leukemia virus (MuLV)2. 人免疫缺陷病毒 Human immunodeficiency viruses (HIV)3. 人T淋巴细胞病毒 Human T-cell lymphotropic viruses (HTLV) 4. 慢病毒 Lentinovirus,DNA病毒载体 DNA viruses1. 腺病毒Adenoviruses2. 腺相关病毒Adeno-associated viruses (AAV)3. 单纯胞疹病毒Herpes simplex virus (HSV)4. 痘病毒Pox viruses5. 滤泡病毒Foamy viruses,非病毒载体Non-viral vectors1. 脂质体Liposomes2. 裸DNA Naked DNA3. 脂质体-聚阳离子复合物Liposome-polycation complexes4. 多肽传递系统Peptide delivery systems,病毒载体的类型,重组型病毒载体(Recombinant virus vectors)以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制和包装所需的顺式作用元件不变。通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中，将外源基因表达盒（Exogenous gene expression cassette）插入穿梭质粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中，与辅助质粒（含有腺病毒基因组的质粒如JM17或pBHG）共转染293细胞，通过细胞内的同源重组获得含有外源基因的重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）。,无病毒基因的病毒载体（Gutless vectors）在不同的病毒载体系统中的称谓不同。对于腺病毒，一般称为mini-Ad；在HSV载体系统，一般称为扩增子（Amplicon）载体或质粒型载体。重组AAV载体也属于无病毒基因的病毒载体。由载体质粒和辅助系统组成。重组载体质粒主要由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成。辅助系统包括病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件。在辅助系统的作用下，重组载体质粒（包含或不包含质粒骨架）以特定形式（单链或双链，DNA或RNA）被包装到病毒壳粒中，其中不含有任何病毒基因。优点在于载体病毒本身安全性好，容量大。缺点在于往往需要辅助病毒参与载体DNA的包装，而辅助病毒又难以同载体病毒分离开来，造成最终产品中辅助病毒污染，从而影响其应用。,基因治疗临床试验采用的载体系统,病毒载体的顺式作用元件和经典包装方式,常用病毒载体的特性和适用范围,Advantages:Randomly integrates into genomeWide host rangeLong term expression of transgeneDisadvantages:Capacity to carry therapeutic genes is smallInfectivity limited to dividing cellsInactivated by complement cascadeSafety,Life cycle of a retrovirus,Gene therapy constructs maintained at this stage.,Adenovirus,Advantages:Efficiency of transduction is highHigh level gene expressionSlightly increased capacity for exogenous DNADisadvantages:Expression may be transientCell-specific targeting difficult to achieveVirus uptake is ubiquitousSafety,Other viral vectors,Adeno-associated virus infects wide range of cells (both dividing and non-dividing), able to integrate into host genome, not associated with any human disease, high efficiency of transduction.Herpes simplex virus, vaccinia virus, syndbis virus, foamy viruses not yet widely studiedOnyx virus limited replicating adenovirus that replicates mainly in tumor cells.,1. Liposome,2. Cationic polymers,Non-viral vectors,May overcome limitations with viruses including small capacity for therapeutic DNA, difficulty in cell-type targeting and safety concerns.,4. Peptide-mediated gene delivery,3. Naked DNA,Steps in synthesis of a therapeutic gene therapy gene construct,Arrangement of native retrovirus genome,Synthesis of a retroviral gene therapy vector,Site of insertion of therapeutic gene,基因转移方法系统,基因转移的筛选系统,阳性选择系统隐性基因互补作用基因胸腺嘧啶激酶基因(thymidine kinase gene, tk) 二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolic reductase gene, dhft) 次黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖基转移基因(hypoxanthine guanine phoshporibosyl-transferase gene, hgpt)氨基甲酰磷酸合成酶天冬氨酸转氨甲酰酶二氢乳清酸酶(CAD) 鸟氨酸脱羧酶(GDC),显性抗性基因新霉素磷酸转移酶基因(neomycin phoshpotransferase gene, neo) 黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(xanthine guanine phosphoribosyl-transferase gene, xgprt) 腺嘌呤核苷脱氨酶(adenosine deaminase, ada) 天冬酰胺合成酶(asparagines synthetase gene, as) 多药物抗性基因(human multidrug resistance gene, mdr),湿霉素-B-磷酸转移酶(hygromycin resistant gene, hph) 突变的二氢叶酸还原酶(mDHFR)金属硫蛋白基因(MT) 腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因(adenine phosphoribosyl-transferase gene, aprt) 色氨酸合成酶基因(trytophane synthase gene) 组氨醇脱氢酶基因(histidinol dehydrogenase gene, hisD) 乌本苷抗性基因(ouabain resistant gene, ouar),阴性选择系统在负性选择系统中，携带某个活性基因的细胞在选择培养基中被杀死，而不带有该基因，或该基因因为各种原因被灭活的细胞则存活下来，其作用机理是某基因产物对细胞有毒性或者能将培养液中的一些成分转变为对细胞有毒性的物质。有时此类基因也称为“自杀性基因”，被用于肿瘤的基因治疗中。胞嘧啶脱氨酶基因(cytosine deaminase gene, CD) 胸苷激酶基因(thymidine kinase gene, tk ) 白喉毒素A链基因(diphtheria toxin A chain gene, DT-A),转移基因的表达,治疗基因的表达水平治疗基因的持续时间治疗基因的可调控表达治疗基因的组织特异性表达基因表达的检测,基因表达诱导系统,靶向基因治疗,基因治疗的理想：修复突变基因，恢复正常的基因表达及其调控机制现行基因治疗：附加基因或其表达产物的治疗，故又称基因替代疗法靶向基因治疗的意义：选择性针对患病组织细胞选择性针对突变基因：突变基因的原位修复减少不必要的副作用，提高安全性,转移基因的同源重组,转移DNA 细胞核 染色体整合 附加体形式随机整合(常见) 同源重组(稀有),基因修复：鉴定并修复错误基因,基因靶向治疗的策略,逆转录病毒介导的靶向基因转移,一、逆转录病毒转导的细胞类型的选择调节1、改变Mo-HLV感染谱 按宿主范围可将Mo-HLV分为三类：单向性：只能感染啮齿类细胞；异向性：可感染除啮齿类动物细胞以外的其它的细胞；双向性：可感染人及啮齿类动物等大多数细胞。感染细胞的类型是由病毒的外壳蛋白env确定的。（1）病毒与抗体的偶联：为了使逆转录病毒定向感染所需要的靶细胞，可将病毒与抗体偶联，该抗体则针对所需感染细胞上特有的抗原。如使单向感染病毒与抗人MHC-1。MHC-II的抗体偶联或与抗人表皮生长因子的抗体偶联后，可以感染人类细胞。Goud等使用此法使单向病毒感染人的肝细胞，可惜病毒未能整合入肝细胞基因组，可能其中还有其它原因。,（2）病毒外壳蛋白与配体偶联： 如将env蛋白与乳糖偶联成去延酸糖蛋白，用此法改造的单向逆转录病毒将不再感染原先的宿主而只感染人的肝细胞，因为只有肝细胞表面上含有去延酸糖蛋白的受体。 （3）改变病毒外壳蛋白的识别序列：已发现env蛋白与被感染细胞受体相识别部位的化学组成，如果改变核表位的基因序列，就可能改变感染细胞的类型，但Etienne等认为有一个潜在的、非病毒原有的表位与细胞受体识别之后不能使病毒内化。一种可行的方法是同时表达原有的env蛋白，就能解决内化问题。,2、使用其它逆转录病毒载体： 牛白血病逆转录病毒，猿免疫缺陷病毒，鼠乳腺肿瘤病毒有组织专一性感染的特点，有些研究组利用其作为载体。Page等采用HIV作为病毒载体，Rizvi等用BLV作载体，Morris等采用MMTV作载体，并构建了MMTV独特的包装细胞，使病毒滴度提高百倍以上，但同Mo-MLV相比，其它病毒的滴度偏低。,3、以嵌合逆转录病毒为载体 逆转录病毒感染谱是由病毒颗粒决定的，改变病毒颗粒蛋白，即env基因改变感染宿主范围。Laudau等用鸟逆转录病毒和RSV的env基因取代 Mo-MLVR env基因，Miller等用长臂猿白血病病毒的env基因嵌合 Mo-MLVR成功感染了多种细胞，并取得较高的滴度Gong等用流感病毒的血凝素取代RSV的env基因蛋白，将血凝素成功地嵌入病毒外壳，并能有效感染人和鸟类细胞Jane等用泡状口炎病毒G糖蛋白取代莫洛尼病毒env蛋白，使该病毒颗粒能成功地感染非哺乳动物如Zebra fish细胞，更重要的是这种病毒外壳可耐受超离心而不影响感染效率，因此有利于浓缩病毒，提高滴度。,目的基因组织专一性表达的调节,1、肝专一性表达肝专一性表达多采用磷酸烯醇式酮酸羧激酶的启动子。McGrane 等用了转基因动物技术使该启动子表达外源基因，证明该启动子专一性地在肝和肾等中表达；Hatzoglau等用PEPCK启动子与neo基因或牛生长因子重组入逆转录病毒载体。克隆后经腹腔注射入子宫感染鼠胎肝或注入门静脉并切除部分肝，证实前病毒可整合肝细胞基因组，并持续表达了八个月之久，而且牛生长因子表达量受食物刺激信号的调节。,另一个肝专一性表达的片段是A-胰蛋白酶基因的顺式作用因子。Simon等的研究表明，-AT基因上游是决定肝专一性表达的片段，（-13737）为最短的肝专一性表达的片段。Peng等用-AT的（-730-30）片段与SV40启动子融合驱动人苯丙氨酸羟化酶基因，使其在肝脏专一性表达，为苯丙酮尿症基因治疗奠定了基础。,-FP为肝癌细胞特有的高效表达产物，Watanabe等发现其上游调控区（-37003300）决定了-FP在肝癌中的专一性表达。Huber等将片段与你腺嘧啶激酶基因融合，克隆入逆转录病毒后转染肝细胞，然后给予无毒性原药-阿拉伯糖核苷，只有肝癌细胞才专一性地合成TK，Pro-ara-MF转化成细胞毒性ara-ATP，造成肝癌细胞的死亡，而其它感染了-EF-TK的细胞不受影响。,受体介导靶向基因治疗,2、肌肉专一性表达 肌肉中高效表达的是肌苷激酶的调控片段。Johnson等发现MCK调控区有两个增强子：一个位于（-12561049），决定肌肉和心肌专一性表达，另一个位于第一内含子（7381599），只决定在心肌的高