《江南大学开题报告》PPT课件.ppt

直博工作汇报汇报人 李蓓 个人简介 2003年7月毕业于河南师范大学生命科学学院生物技术专业 同年9月开始攻读山东大学生命科学学院细胞生物学专业硕士 师从张举仁教授 研究方向为植物细胞工程与基因工程 目前已修完硕士研究生培养方案规定的课程 成绩优秀 此外 选修了基因组学与蛋白质组学专题 分子细胞生物学进展 细胞分化等博士生课程 阅读了 植物分子遗传学 从基因到基因组 等专业书目 在理论水平上有一定提高 除课程学习 实验室研究工作正常进行之外 还大量阅读与专业有关的各类文献资料 思路方面有了一定的扩展 已经熟练掌握了农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化技术 掌握了质粒重组 DNA和RNA的提取 PCR及SDS PAGE等分子生物学技术 从黑豆及荷豆2 中克隆了hsp热诱导启动子 并进行了功能验证 参与重组酶FLP的克隆和重组酶作用位点frt的构建 并将它们构建入植物表达载体 转化烟草进行了功能验证 下一阶段的工作计划和目标 利用FLP frt系统去除转基因玉米的选择标记及耐盐相关基因的聚合 实验目的 利用FLP frt定点重组系统 获得去除选择标记基因的玉米转基因植株 利用二次转化或者有性杂交的方法获得去除选择标记基因的基因聚合植株 探索高效获得无选择标记基因植株的途径与方法 实验背景 选择标记基因被广泛的用于植物转基因中转化子的筛选工作 目前最常用到的选择标记基因大多数为抗性标记基因 resistantmarkergene 随着转基因植物的商品化种植 抗性标记基因在生态环境和食用方面潜在的安全性隐患就成为颇有争议且悬而未决的问题 因此培育无抗性标记基因的转基因植物已成为基因工程育种的重要目标 完全避免使用抗性标记基因使用安全性标记基因获得转基因阳性植株后将抗性选择标记基因除去共转化系统 Co transformationsystem 以转座元件为基础的系统 Transposableelement basedsystem 同源重组系统 Homologousrecombination 染色体内部的重组系统 Intrachromosomalrecombinationsystem 位点特异性重组系统 Site specificrecombinationsystem 在植物基因工程中常用的位点特异性重组系统主要有以下几种 来自于噬菌体P1的Cre lox系统来自于酿酒酵母的2 m质粒中的FLP frt系统来自于接合糖酵母Zymosaccharomycesrouxxi的pSR1质粒的R RS系统来自于Mu噬菌体的Gin重组酶系统 FLP frt定点重组系统来自于酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae 的2 m质粒 该系统包括 FLP重组酶 FLPrecombinase frt FLPrecombinationtarget 重组酶作用位点 FLP酶催化frt位点间的特异性重组 根据frt位点位置和方向的不同 催化DNA片段的倒位 切除和整合 1993年 Lyznik等利用FLP酶的瞬时表达系统 以玉米和水稻的原生质体为材料首次证明了FLP frt系统在植物中的定点重组功能 1994年 Lloyed和Davies通过对烟草稳定转化体的研究验证了FLP frt系统的功能 1996年 Lyznik等通过对玉米愈伤组织的研究也证明了该系统的功能 2000年 HongLuo等利用FLP frt重组系统从雄性不育的转基因拟南芥植株中获得了育性恢复的植株 表明该系统可为杂交种或杂交植物的获得提供一条可供选择的途径 工作基础 已构建植物表达载体 pCAMBIA1300 35S flp hptpCAMBIA1300 35S antiport frt1 als frt2pCAMBIA1300 35S CDH frt1 als frt2pCAMBIA1300 35S hsp1 flp hptpCAMBIA1300 35S hsp2 flp hpt已构建原核表达载体 pET 42 b FLP 图为含有重组酶FLP基因的植物表达载体pCAMBIA1300 FLP 图为选择标记基因两侧带有同向frt位点的植物表达载体 Fig EnzymedigestedcharacterizationofpCAMBIA1300 antiport frt1 als frt21 pCAMBIA1300 antiport frt1 als frt2 Xba 2 pCAMBIA1300 antiport frt1 als frt2 BamH 3 pCAMBIA1300 cdh frt1 als frt2 BamH 4 pCAMBIA1300 antiport frt1 als frt2 Xho 5 pCAMBIA1300 antiport frt1 als frt2 EcoR 6 EcoT14 7 DL2000 Fig EnzymedigestedcharacterizationofpCAMBIA1300 flp hpt1 pCAMBIA1300 flp hpt Hind 2 pCAMBIA1300 flp hpt EcoR 3 pCAMBIA1300 flp hpt BamH Kpn 4 DL2000 其中 pCAMBIA1300 35S flp hpt pCAMBIA1300 35S antiport frt1 als frt2以及pCAMBIA1300 35S CDH frt1 als frt2三种植物表达载体已经转化烟草并且得到了阳性植株 通过二次转化和共转化的方法在烟草中鉴定了FLP frt定点重组系统的功能 得到了去除选择标记基因仅带目的基因的烟草植株 将pET 42 b FLP原核表达载体转入E coli的DE3 BL21 株系中并进行表达 通过SDS PAGE电泳得到了表达的FLP重组酶的48KDa的目的条带 工作计划 构建植物表达载体 pCAMBIA1300 Ubiqutin flp bar UFB pCAMBIA1300 Actin antiport frt1 als frt2 AAFA pCAMBIA1300 Ubiqutin PPase frt1 als frt2 UPFA 转化玉米芽尖及愈伤组织 成苗后经分子生物学检测得到转基因阳性植株 然后通过二次转化或有性杂交的方法获得去除选择标记基因的玉米转基因阳性植株 去除选择标记基因的基因聚合玉米植株的获得 在获得去除选择标记基因的转单基因的阳性植株基础上 使带有单基因的植株之间进行有性杂交 筛选后代以获得基因聚合的阳性植株 在得到转单基因的阳性植株基础之上 进行二次转化或者有性杂交 对其后代进行分子生物学检测 得到含有两个目的基因的阳性植株 将其与含有FLP重组酶的阳性植株进行有性杂交 经过检测可以得到去除选择标记基因的基因聚合植株 在获得去除选择标记基因的转单基因的阳性植株后 利用二次转化或有性杂交的方法将第二个目的基因 其选择标记基因的两侧带有同向的frt位点 导入 在原阳性植株中的FLP重组酶的作用下将带有第二个目的基因的表达载体中的选择标记基因去除 同时实现目的基因的聚合 构建植物表达载体 pCAMBIA1300 hsp flp bar转化玉米芽尖及愈伤组织 成苗后经分子生物学检测得到转基因阳性植株 通过在不同时期 不同温度条件下对植株的不同部位进行热激 诱导由热诱导启动子启动的重组酶FLP的表达 检测该酶的表达水平 以确定诱导重组酶表达的最佳条件 探索重组酶作用位点frt的长度及串联个数对重组效率的影响 构建不同长度的位点序列的两串联重复和三串联重复 frt1 78bpfrt2 78bpfrt1 96bpfrt2 96bpfrt1 117bpfrt2 144bp将这些成对的位点序列置于需要删除的基因两侧 重组质粒后转入E coli 提取质粒鉴定后 将质粒与纯化的FLP重组酶共同孵育 检测重组事件是否发生 一点设想 在获得去除选择标记基因的转单基因的阳性植株A基础上 构建带有不同目的基因的植物表达载体B 使B仅在目的基因的一侧带有单一frt位点 然后用植物表达载体B对A进行二次转化 期望A中的FLP重组酶仍然发挥作用 催化两个frt位点之间的重组 经过检测 也许可以拿到含有两个目的基因 而不含标记基因的阳性植株 请各位老师批评指正 酿酒酵母中广泛存在的2 环是双链环状的DNA质粒 其结构上最为显著的特点是存在两个599bp的反向重复序列 IR 这两个IR序列之间容易发生重组 使2 环在酵母细胞中存在A和B两种不同的构型 并且对于2 环在酵母细胞中维持高拷贝数具有十分重要的作用 2 环分子内发生的DNA重组属于位点特异性重组 由2 环自身编码的FLP重组酶催化 FLP重组酶作用的靶序列为2 环的两个IR序列中48bp的FRT位点 FRT位点由3个13bp的FLP重组酶结合区和一个跨越XbaI位点的8bp间隔区所组成 FLP重组酶可以介导三种类型的DNA重组反应 当两个FRT位点位于同一条DNA分子上 且为顺向排列时 重组的结果会导致两个FRT位点之间的DNA片段被切离 当两个FRT位点反向排列时 重组的结果则导致两个FRT位点之间的DNA片段发生倒位 当两个FRT位点分别位于两条DNA分子上时 重组的结果则导致DNA发生相互易位 TheprincipleofCo transformationAproportionoftransformedplantscarryingtheselectablemarkergenewillalsohaveintegratedtherequiredinterestgeneatasecondunlinkedinsertionsite Markergenescanberemovedbygeneticsegregation Thestrategyoftransposableelement basedsystemConnectingeithertheinterestgeneortheselectablemarkerwithtransposablesequencesinsuchawaythatthetwoentitiescanbeseparatedfromeachotherinacontrolledreactionaftertransformationandselection Markergenescanberemovedbygeneticsegregation DisadvantageLowfrequencyThelowfrequenciespartlyduetothetendencyoftransposableelementstoreinsertelsewhereinthegenome GenomicinstabilityExcisionoftransposonsisfrequentlyimpreciseRepeatedcyclesofinsertionandexcisionmayleadtothegenerationofmutationsatnumerousunknownloci Deletionofsequencespositionedbetweendirectrepeatsinthegenomeviahomologousrecombinationoccursatlowfrequenciesinsomaticcells e gintra