GPD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验

G6PD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验,2010级临床八大班第四实验室,组员：,主讲：,患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（+），潜血(+)，尿胆红素()，尿胆素原(+)， 尿液镜下未见红细胞。,案例：,1. 根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？,蚕豆病起病急遽，大多在进食新鲜蚕豆后12天内发生溶血，最短者只有2小时，最长者可相隔9天。如因吸入花粉而发病者，症状可在数分钟内出现。潜伏期的长短与症状的轻重无关。本病的贫血程度和症状大多很严重。症状有全身不适、疲倦乏力、畏寒、发热、头晕、头痛、厌食、恶心、呕吐、腹痛等。巩膜轻度黄染，尿色如浓红茶或甚至如酱油。一般病例症状持续26天。最重者出现面色极度苍白，全身衰竭，脉搏微弱而速，血压下降，神志迟钝或烦躁不安，少尿或闭尿等急性循环衰竭和急性肾功能衰竭的表现。,蚕豆病发病机理：,1.蚕豆病的遗传机理 蚕豆症是一种性染色体隐性遗传,意思是女性的一对X性染色体都带有疾病基因才会发病，男性只有一个X性染色体，所以只要这个X染色体异常就会发病。只有一个异常X染色体的女性没有症状，但是她们所生的男孩如果得到这个异常的X染色体，就会发病。,2.蚕豆病的诱发机制 蚕豆病属先天性酶代谢缺陷遗传病，与体内红细胞缺乏葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PD）有关。在正常情况下，人体红细胞有一种具抗氧化作用的物质谷胱甘肽。G6PD缺乏者，谷胱甘肽尤其是还原型谷胱甘肽明显减少，致使红细胞对氧化作用十分敏感。 食入新鲜蚕豆后，蚕豆中所含的巢菜碱甙物质，可使血液中的氧化性物质增多，导致红细胞被破坏，从而发生以黄疸和贫血为主要特征的全身溶血性反应。,2.请设计实验进一步明确诊断 要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。,G6PD缺乏症的检查方法：,高铁血红蛋白还原实验,变性珠蛋白小体生成实验（可做为G6PD缺乏的筛选实验）,G6PD活性测定,G6PD荧光斑点实验（特异性较好、方法简单）,抗坏血酸-氰化物实验,硝基四氮唑蓝定量法,G6PD比值法,高铁血红蛋白还原实验,高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查,实验名称：高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查,高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查,实验原理： 在有足量的还原辅酶（NADPH)存在下，反应液中的高铁血红蛋白能被高铁血红蛋白还原酶即细胞色素b5（黄素酶）还原成亚铁血红蛋白。在体外，这一还原过程还需要递氢体亚甲蓝的参与。但红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成NADPH的数量足以完成上述还原反应。当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。高铁血红蛋白呈褐色，在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计加以测定。,高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查,实验试剂：0.18 mol/L亚硝酸钠和0.28mol/L葡萄糖混溶液 亚硝酸钠1.25g、葡萄糖5.0g、蒸馏水溶解，并加至100ml储存于棕色瓶中，放4冰箱，可保存一个月0.4mmol/L亚甲蓝溶液 亚甲蓝（含3个结晶水）0.15g，蒸馏水加至100ml。先将亚甲蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨，待溶解后移到100ml容量瓶中，在再加蒸馏水至100ml，混匀过滤，此液可贮存3个月。0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.4）磷酸氢二钠229.5mg、磷酸二氢钾52.2mg，加蒸馏水至100ml。或用0.0667mmol/L PH 7.4磷酸盐缓冲液稀释3倍。109mmol/L枸橼酸钠溶液（32g/L）,高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查,操作：,1.在试管中加入葡萄糖20mg，109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml,静脉血1.8ml,混匀。,2.离心15min，取出，调整血细胞与血浆的比例为 1：1 后混匀。3.取上述抗凝血1ml,加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚甲蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与氧气充分接触，加塞后放37水浴或孵箱中3h。,高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查,4.孵育后混匀，取血0.1ml，加PH 7.4 磷酸盐缓冲液10ml，混匀，2min后在波长635nm处测定吸光度（设为SA）,5.空白对照，用未加亚硝酸纳葡萄糖的血液，同样孵育后取0.1ml,加PH 7.4 磷酸盐缓冲液10ml，2min后测定吸光度为B。然后加入亚硝酸钠葡萄糖混合溶液1滴，混匀，5min后再测其吸光度为ST，此为高铁血红蛋白对照,高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查,计算：,高铁血红蛋白还原率（%）= 1 (SA-B)/(ST-B)100%,式中：SA-B、ST-B分别为还原后和还原前高铁血红蛋白的吸光度； SA-B/ST-B为还原后剩余高铁血红蛋白的比值。,高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查,注意事项：,对于贫血患者应将红细胞比容调整在0.350.40（35%40%）草酸盐抗凝剂具有还原性，不宜使用。试剂的比例要准确，否则易产生假阳性或假阴性。标本不应有凝块或溶血，以免影响测定结果。,高铁血红蛋白还原实验 G6PD缺乏症检查,结果分析：,高铁血红蛋白还原实验（MHb）正常人还原率75%(比色法）蚕豆病患者MHb还原率31%74%（杂合子遗传者）还原率30%（纯合子型）,患者如存在高铁血红蛋白（HbH）、不稳定血红蛋白、高脂血症、巨球蛋白血症等均可造成假阳性。NADPH-MHb还原酶缺乏（罕见）也可出现阳性结果,3. 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验检查结果。,红细胞和血红蛋白含量减少原因：G6PD缺陷 不能通过磷酸戊糖途径提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽 红细胞脆性增加，易于破裂 红细胞在遇到蚕豆中的某些强氧化剂时，细胞膜破坏 红细胞减少,实验检查结果：,大量血红蛋白释放,形成原尿后，超过肾小管和集合管的重吸收作用,尿蛋白量增加,形成酱油样尿,胆红素增加,红细胞减少,实验检查结果：,单核吞噬系统,红细胞大量破坏 单核吞噬细胞系统产生胆红素增加 超过肝摄取、转化和排泄的能力 未结合胆红素浓度增加（血浆胆红素、未结合胆红素含量增高、结合胆红素浓度改变不大） 当超过34.2mmol/L时出现显性黄疸,肝对胆红素的摄取、转化和排泄增多 进入胆道系统肠肝循环 尿胆原和尿胆素增多,实验检查结果：,实验检查结果：,潜血：潜在的出血，也就是由肉眼下或是显微镜下无法观察到有红血球的存在，但如果用试纸检验时却有反应，当红血球被破坏时，其内含的血红素会释放出来，所以，尿液试棒才能侦测到血红素的反应。尿液下没有见红细胞可能是因为红细胞本身的寿命已到，也可能是喝了大量水，尿液稀薄红血球破裂。,临床表现：,血压降低,溶血性贫血,血红蛋白量减少,O2供应不足,呼吸急促、微弱,面色苍白,红细胞大量破坏,白细胞、巨噬细胞、血小板增多,炎症反应,体温升高,心率、脉搏加快,胃肠血流量不足,胃肠道平滑肌痉挛收缩,恶心、呕吐,4. 要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？,可使用技术：扩增G6PD基因第10、11、12、13外显子639bpDNA片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术PCR/SSCP片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术PCR/SSCP分析法DNA序列分析探针技术,G6PD 基因定位于 X 染色体长臂 2 区 8 带因子及 18Kb，中国人 红-绿色盲基因之间（Xq28）,长 18Kb，中国人 G6PD 基因 绿色盲基因之间（Xq28） Xq28 目前依法显得突变种类很多，但能引起题目中所诉临床症状 G1376和 G6PD 的突变点可能是 G1376和 G1388A 点突变 G6PD 基因含 （