《液相色谱应用技术》PPT课件.ppt

戴安中国HPLC用户培训2011年 美国戴安公司美国戴安公司 美国戴安公司 美国戴安公司 戴安中国有限公司 液相色谱应用技术 戴安中国有限公司 3 提纲 1 HPLC的广泛应用2 色谱柱子的选择性和应用3 色谱柱的使用和维护保养4 液相色谱仪系统清洗 4 一 HPLC的广泛应用 据2004年统计 世界上化合物总数多达4700多万种在全部有机化合物中仅有20 左右的样品适用于GC分析而HPLC可对80 左右的有机化合物进行分离和分析 5 HPLC的广泛应用 HPLC特别适用于高沸点 大分子 强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备在医药 食品 农业 生命科学 化工 环保等领域都有着广泛的应用潜力 6 HPLC的应用领域 在食品研究中的分析应用食品中的天然成分类脂化合物 甘油三酸酯 胆固醇碳水化合物脂肪酸和有机酸蛋白 肽 氨基酸食品添加剂酸味剂 甜味剂 香精 乳化剂抗氧化剂 防腐剂色素维生素污染物霉菌 黄曲霉毒素 农药残留和兽药残留多环芳烃 PAHS 和亚硝酸 7 HPLC的应用领域 在医药研究中分析应用药物分析有USP BP CP等标准常用药物研究中的应用 解热镇痛药 镇静药 安定药 心血管药 磺胺类消炎药等 甾体药物研究中的应用 肾上腺皮质激素 雄性激素 雌性激素和孕激素等 抗菌素类药物研究中的应用 青霉素 头孢菌素 庆大毒素 四环素 氯霉素 诺氟沙星等 中草药研究中的应用 生物碱 甙类 皂甙 强心甙 黄酮甙等 萜类手性药物研究中的应用 光学异构体的拆分 如解毒剂D 青霉胺毒性小 L 异构体毒性很强 医疗药物的检测 新药研究 药物代谢 药代动力学研究 在兽药研究中分析应用 8 HPLC的应用领域 在生物化学和生物工程中的应用氨基酸 多肽合成和蛋白质的分析研究核碱 核苷 核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究 儿茶酚胺类 在精细化工分析中的应用醇 醛和酮 醚的分离分析酸和酯的分离分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究药物 农药 染料 炸药等工业产品 9 HPLC的应用领域 化妆品行业要控制和分析 防腐剂 防晒剂 性激素以及维生素等 在公安 刑警破案工作需要 投毒药物 毒品分析等在环境污染分析中的应用 废气 废水 废渣中多环芳烃 多氯联苯 农药残留 酚类 胺类和二恶瑛的检测 在无机离子分析中应用 饮用水 酸雨 土壤中阴离子和阳离子分析 10 二 色谱柱的选择和应用 非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18柱 PH范围2 9 12 强极性化合物一般采用离子交换柱糖类 氨基酸 有机酸 多环芳烃 GPC有专用柱正相柱 硅胶柱 CN氰基柱 NH2氨基柱戴安新型柱 PA PAII WAX WCX LILIC 1 Trinity 11 选择柱子的重要性 不同的分析对象选择不同的柱子不同公司有不同品牌和不同种类填料的柱子HPLC色谱柱子品牌杂种类多C18柱子填料末端封尾的重要性 12 键合相色谱柱 以硅胶为基质 通过化学键合方式把碳十八 碳八 胺基等基团联在基质上作为固定相 这种固定相要占所有柱填料的70 80 优点 固定相稳定 不易流失应用广泛 可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点 pH值不能小于2或大于8同样填料 各种牌号色谱柱不尽相同 13 HPLC测定糖 正相氨基柱 示差检测 Analyticalcolumn UltimateXB NH2 4 6 250mm 5 mat30oCMobilePhase ACN H2O V V 65 35 Flow 1 0mL minDetection RIat30oCPeaks Conc mg mL 1 木糖2 02 果糖2 03 葡萄糖2 04 蔗糖2 05 麦芽糖2 06 乳糖2 07 麦芽三糖2 08 麦芽四糖2 0 Re mixthemobilephasescanensuretheflatbaseline 14 HILIC柱与CAD检测器分析糖类化合物 14 LC Ultimate3000column HILIC5um4 6x250mmFlow 1 0mL minDetection CADultra 30 CMP ACN H2O 70 30 核糖 半乳糖 15 样品 1 门东氨酸 Asp 2 丝氨酸 Ser 3 谷氨酸 Glu 4 甘氨酸 Gly 5 组氨酸 His 6 氨 NH3 7 精氨酸 Arg 8 苏氨酸 Thr 9 丙氨酸 Ala 10 脯氨酸 Pro 11 光氨酸 Cys 12 酪氨酸 Tyr 13 缬氨酸 Val 14 蛋氨酸 Met 15 赖氨酸 Lys 16 异亮氨酸 ILeu 17亮氨酸 Leu 18 苯丙氨酸 Phe 分析条件 DIONEX U 3000HPLC样品 20ul 戴安C18柱应用 17种氨基酸分析 样品 1 门东氨酸 Asp 2 丝氨酸 Ser 3 谷氨酸 Glu 4 甘氨酸 Gly 5 组氨酸 His 6 氨 NH3 7 精氨酸 Arg 8 苏氨酸 Thr 9 丙氨酸 Ala 10 脯氨酸 Pro 11 光氨酸 Cys 12 酪氨酸 Tyr 13 缬氨酸 Val 14 蛋氨酸 Met 15 赖氨酸 Lys 16 异亮氨酸 ILeu 17亮氨酸 Leu 18 苯丙氨酸 Phe 16 17种氨基酸标样实时记录色谱图 虚线为流动相梯度变化曲线 17 戴安C18柱应用 9种防腐剂同时分析 Peaks 1 溴硝醇2 苯甲醇3 对羟基苯甲酸甲酯4 苯甲酸5 对羟基苯甲酸乙酯6 对羟基苯甲酸异丙酯7 对羟基苯甲酸丙酯8 对羟基苯甲酸异丁酯9 对羟基苯甲酸丁酯 Column AcclaimC18 5 m 4 6x250mmMPA MeOHMPB ACNMPC 50mMKH2PO4 pH3 5Temperature 30 CFlowRate 1 1mL minInj Volume 10 LDetection UV 254nmMethod A B C 40 15 45 18 饮料中防腐剂分析戴安AcclaimC18柱 250 4 6 5u1ml min 90 10缓冲盐和甲醇 19 饮料中防腐剂分析ZorbaxC18 150 3 0 5u 0 5ml min 93 7缓冲盐和甲醇 20 13种防晒剂的测定 20 1 苯基苯丙咪唑磺酸2 二苯酮 4 二苯酮 53 二苯酮 34 p 甲氧基肉桂酸异戊酯5 甲基苄亚基樟脑6 PABA 乙基己酯 对氨基苯甲酸 7 奥克立林8 p 甲氧基肉桂酸乙基己酯9 水杨酸乙基己酯10 胡莫柳酯11 乙基己基三嗪酮12 亚甲基双 苯并三唑基四甲基丁基13 双 乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪 Column AcclaimC18 5 m 4 6x250mmMPA MeOHMPB THFMPC Water 每300ml水中含0 2ml高氯酸 Temperature 30 CFlowRate 1 0mL minInj Volume 10 LDetection UV 311nm Time min B C 0453013 0453020 0531527 0501040 05010 21 色谱条件 戴安公司SummitHPLC 荧光检测器 PickeringLabs公司的柱后衍生仪荧光检测 EX330nm EM465nm流动相 水 乙腈梯度洗脱 0 8ml min柱子 C18柱衍生试剂流速 0 3ml min反应器1 温度100 C 0 5ml min反应器2 环境温度 0 1ml min 氨基甲酸酯杀虫剂柱后衍生荧光检测 22 PeakNo Name1VB12VC3VB34VB65泛酸钙6VB127叶酸8VB29生物素10VK311VA12VE13VD214VD3 超高柱性能 14种水溶性和脂溶性维生素同时分离 可完全兼容100 水相和100 有机相超高仪器性能 一次分析过程中可同时改变流动相比例 流速和检测波长 戴安PA2 C18 柱应用 23 23 4种雌性激素的测定 1 雌三醇2 雌酮3 雌二醇4 己烯雌酚 Column AcclaimPAII 3 m 2 1x150mmMPA MeOHMPB WaterTemperature 30 CFlowRate 0 3mL minInj Volume 1 LDetection UV 204nmIsocratic A B 60 40 24 戴安PA柱应用 25 25 戴安公司Acclaim系列色谱柱及其研发历史 除了完善常规反相色谱柱外 近年的主要的研发精力放在了混合基质的色谱柱上使用混合基质色谱柱益处不同类型物质同时分离可调整选择性简化流动相 AcclaimPolarAdvantage PA Acclaim300C18 Acclaim120C18Acclaim120C8 2000 AcclaimSurfactantAcclaimPolarAdvantageII PA2 AcclaimOrganicAcid OA AcclaimExplosivesE1AcclaimExplosivesE2 AcclaimMixed ModeHILIC HPLC2007 AcclaimMixed ModeWAX PittCon2007 HPLC2003 HPLC2002 PittCon2001 PittCon2005 PittCon2004 PittCon2006 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Acclaim2 2 mRSLC HPLC2008 AcclaimMixed ModeWCX PittCon2008 2009 2010 Westartedhere AcclaimTrinityP1 PittCon2009 MoreAcclaim2 2 mRSLC 26 小分子分析面临的挑战 RP柱 如C18 用途最广泛 但 存在二级作用 在中性淋洗液条件下 碱性化合物拖尾对高极性 亲水性 化合物保留很弱选择性有限RP柱 离子对试剂 分离亲水性带电化合物平衡时间长使用专用柱流动相复杂 MS不兼容 IEX柱 分离带电化合物疏水性差 限制了使用HILIC NP柱 分离高度亲水的化合物疏水性差 限制了使用 27 混合模式固定相 定义疏水性相互作用 离子交换作用类型WAX RP SAX RPWCX RP SCX RP两性离子 RP 两性 RP优势选择性可调节流动相组成简单可同时分离不同类型的化合物 28 各种不同的混合基质制作方式 29 戴安特色混合基质色谱柱 WAX 1 WCX 1 HILIC 1 TrinityP1 硅胶颗粒涂布Nano polymer微球孔内部 RP WAX外表面 SCX 30 特征 选择性可调节分离阴离子化合物具有理想的选择性选择性是RP柱的补充多种模式分离机理 反相 阴离子交换 阳离子排斥和HILIC 硅胶 高纯 多孔 球形颗粒大小 5 m表面积 300m2 g孔径大小 120 WAX RP混合模式色谱柱 31 Column Acclaim Mixed ModeWAX 1 5 mDimension 150 x4 6mmMobilePhase 50 50v vacetonitrile phosphatebufferTemperature 30 CFlowRate 1mL minInj Volume 2 LDetection UV 210nm Peaks 1 Butylbenzene 0 1mg mL 2 4 Hydroxybenzoicacid 0 5mg mL Butylbenzene 4 Hydroxybenzoicacid 通过离子强度调节选择性 0 7 5 15 Minutes AU 1 2 1 2 100mMPhosphatebuffer pH6 20mMPhosphatebuffer pH6 23773 32 Column Acclaim Mixed ModeWAX 1 5 mDimension 150 x4 6mmMobilePhase 50 50v vacetonitrile 20mMphosphatebufferTemperature 30 CFlowRate 1mL minInj Volume 2 LDetection UV 210nm Peaks 1 Butylbenzene 0 1mg mL 2 4 Hydroxybenzoicacid 0 5mg mL 2 1 2 1 pH2 6 pH6 0 通过pH调节选择性 0 7 5 15 Minutes AU Butylbenzene 4 Hydroxybenzoicacid 23774 33 50 Acetonitrile 1 2 1 2 通过有机溶剂含量调节选择性 Column Acclaim Mixed ModeWAX 1 5 mDimension 150 x4 6mmMobilePhase Acetonitrile 20mMphosphatebuffer pH6Temperature 30 CFlowRate 1mL minInj Volume 2 LDetection UV 210nm Peaks 1 Butylbenzene 0 1mg mL 2 4 Hydroxybenzoicacid 0 5mg mL 0 10 20 Minutes AU Butylbenzene 4 Hydroxybenzoicacid 23775 45 Acetonitrile 34 选择性可调节 同时测定碱性API药物及其对离子 35 WAX 1同时分离酸性 碱性和中性化合物 36 WAX 1同时分离酸性 碱性和中性化合物 37 MobilePhase 50 50v vacetonitrile 50mMphosphatebuffer pH2 8forAcclaim Mixed ModeWAX 120 80v vacetonitrile 50mMphosphatebuffer pH2 8forAcclaim120C18columnTemperature 30 CFlowRate 1mL minInj Volume 2 LDetection UV 220nm 0 10 20 Minutes AU AcclaimMixed ModeWAX 1 5 m 150 x4 6mm C18RPColumn 5 m 150 x4 6mm 2 1 3 2 1 3 选择性与RP柱呈正交关系 WAX弱阴离子交换色谱柱 选择性与RP柱呈正交关系 WAX 1 38 戴安WCX 1柱应用 与WAX柱出峰顺序相反 阴离子先出峰 再出中性化合物 阳离子最后出峰 39 39 Column AcclaimMixed ModeHILIC 1 5 mDimensions 150 x4 6mmMobilePhase CH3CN 0 1NH4OAc pH5 2Temperature 30 CFlowRate 1mL minInj Volume 10 LDetection UV 254nmPeaks 100ppmeach 1 Cytosine 胞嘧啶 2 Naphthalene 萘 0 4 8 6 2 10 Minutes AU CH3CN 0 1MNH4OAc pH5 2v v92 8 CH3CN 0 1MNH4OAc pH5 2v v52 48 Reversed PhaseMode HILICMode 2 1 1 2 戴安混合模式HILIC 1柱的应用 RP模式及HILIC模式 40 40 0 12 24 18 6 30 Minutes AU Column AcclaimMixed ModeHILIC 1 5 mDimensions 150 x4 6mmMobilePhase A CH3CNB 0 1MNH4OAc pH5 2Temperature 30 CFlowRate 1 0mL minInj Volume 10 LDetection UV 225nmSample IGEPALCA 630 0 1 HILIC RP A B 99 1 A B 97 5 2 5 A B 95 5 A B 87 5 12 5 A B 75 25 A B 62 38 A B 55 45 A B 52 48 A B 40 60 戴安混合模式HILIC 1柱的应用 RP模式及HILIC模式 41 41 AcclaimTrinityP1 色谱柱化学 高纯 球型 多孔硅胶结构Nano polymerSilicaHybrid NSH 技术 硅胶颗粒涂布Nano polymer微球孔内部 RP WAX外表面 SCX 42 42 Column Acclaim TrinityP1 3 mDimensions 3 0 x50mmMobilePhase 75 25v vCH3CN 30mM total NH4OAc pH5 2Temperature 30 CFlowRate 0 5mL minInj Volume 2 5 LDetection UV 254nm andELSdetectorinseriesSample Na Naproxen 0 5mg mLinmobilephase ONa 全新混合基质色谱柱 Acclaim TrinityP1 UV 254nm CAD Na Naproxen 萘普生 Naproxen 43 43 AcclaimTrinityP1柱 16种药物反离子的同时分析 43 大致出峰顺序为阳离子先出峰 再出中性化合物 阴离子最后出峰 44 戴安专用色谱柱 有机酸分析专用柱 AcclaimOA爆炸物分析专用柱 AcclaimE1 E2表面活性剂专用柱 AcclaimSurfactant 45 有机酸分析 1 Oxalicacid草酸 2 Tartaricacid酒石酸 3 Formicacid甲酸 4 Malicacid苹果酸 5 iso Citricacid异柠檬酸 6 Lacticacid乳酸 7 Aceticacid乙酸 8 Citricacid柠檬酸 9 Succinicacid琥珀酸 10 Fumaricacid富马酸 11 cis Aconiticacid顺 乌头酸 12 trans Aconiticacid反 乌头酸 46 Column AcclaimOrganicAcid OA 5 mDimensions 4 0 x250mmMobilePhase 100mMNa2SO4 pH2 65 adjustedwithmethanesulfonicacid Temperature 30 CFlowRate 0 6mL minInj Volume 5 LDetection UV 210nmPeaks 1 草酸15ppm2 酒石酸1203 甲酸1804苹果酸1205 异柠檬酸1206 乳酸1807 乙酸1208 柠檬酸1209 琥珀酸12010 富马酸711 顺 乌头酸12 反 乌头酸 7ppmtotalforcisandtransisomers 0 025 0 5 10 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 AU Minutes 0 20011 AcclaimOA柱 分离12种有机酸 AcclaimC18andOA柱分离13种有机酸比较 48 22770 Tetryl 2 NT 4 NT 3 NT 2 6 DNT 2 4 DNT 1 3 DNB NB HMX RDX TNT 2 A 4 6 DNT 4 A 2 6 DNT 1 3 5 TNB 2 NT 4 NT 2 A 4 6 DNT 4 A 2 6 DNT 美国EPA8330规定的14种爆炸物检测 49 Peaks 1 HMX2 RDX3 1 3 5 Trinitrobenzene4 1 3 Dinitrobenzene5 Nitrobenzene6 Tetryl7 2 4 6 Trinitrotoluene8 4 Amino 2 6 Dinitrotoluene9 2 Amino 4 6 Dinitrotoluene10 2 6 Dinitrotoluene11 2 4 Dinitrotoluene12 2 Nitrotoluene13 4 Nitrotoluene14 3 Nitrotoluene Column 5 m 4 6x250mmMobilePhase MeOH H2OTemperature 30 CFlowRate 1mL minInj Volume 5 LDetection UV 254nm 22787 Minutes AU 0 18 36 27 9 45 1 2 14 3 4 10 11 9 12 13 5 7 8 6 AcclaimExplosivesE1 1 2 14 3 4 10 11 9 12 13 5 7 8 6 AcclaimExplosivesE2 Peaks 1 HMX2 RDX3 1 3 5 Trinitrobenzene4 1 3 Dinitrobenzene5 Nitrobenzene6 Tetryl7 2 4 6 Trinitrotoluene8 4 Amino 2 6 Dinitrotoluene9 2 Amino 4 6 Dinitrotoluene10 2 6 Dinitrotoluene11 2 4 Dinitrotoluene12 2 Nitrotoluene13 4 Nitrotoluene14 3 Nitrotoluene Column 5 m 4 6x250mmMobilePhase MeOH H2OTemperature 30 CFlowRate 1mL minInj Volume 5 LDetection UV 254nm 美国EPA8330规定的14种爆炸物检测 50 TritonX 100 SodiumXyleneSulfonate SodiumDodecylbenzeneSulfonate LAS m n 10 LauryldimethylbenzylAmmoniumChloride LaurylpyridiniumChloride SodiumDodecylSulfate SDS SodiumDecylSulfate CetylBetaine 22792 各种类型表面活性剂分析 51 Column Acclaim Surfactant 5 mDimensions 4 6x150mmMobilePhase A ACN B 0 1MNH4OAc pH5 4Gradient 25 to85 Ain25min thenhold85 Afor10minTemperature 30 CFlowRate 1mL minInj Volume 25 LDetection ELSdetector Peaks ChlorideBromideNitrateXylenesulfonateLaurylpyridiniumchlorideLauryldimethylbenzyl ammoniumchlorideTritonX 100CetylbetaineDecylsulfateDodecylsulfateC10 LASC11 LASC12 LASC13 LAS mV Minutes 1 2 3 4 5 6 7 10 9 8 11 12 13 14 22793 各种类型表面活性剂分析 52 三 色谱柱的使用及维护保养 流动相的转换特别是GPC柱流速 压力 的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱 样品及溶剂的要求 53 良好的色谱实验习惯 拿到一根新色谱柱时 先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图 并记录条件定期检测柱效 54 色谱柱的保养 一 样品方面样品过滤 除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相 一定要用流动相试溶解度 防止其在流动相中析出了解样品基质与色谱柱的填料是否相互作用 55 样品准备 56 色谱柱的保养 二 流动相方面流动相过滤 除去微粒纯度的要求超纯水 梯度实验时水中有机杂质含量要低 建议走空白检验 缓冲液的pH值 在填料的允许范围内缓冲液 盐 的浓度配制缓冲液的所用试剂纯度要高有机溶剂 色谱纯 并与填料相匹配有机溶剂中的杂质含量及紫外吸收注意溶剂的相容性 避免使用不相容的溶剂流动相对样品的溶解度有机溶剂和水的比例 57 液相色谱用试剂 水 用MILLIQ处理水 18兆欧 如用屈臣氏蒸馏水或娃哈哈瓶装纯水 必须是正宗 有机相 乙腈 甲醇等质量要好 遇下列情况一定要用正宗进口产品1 痕量分析2 低波长3 梯度分析 58 溶剂过滤 除去微粒 不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱 遵从下列建议可以提高性能 延长溶剂过滤器和色谱柱的寿命 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌 用滤膜过滤溶剂去除微生物 每两天更换或过滤溶剂 避免溶剂瓶直接日照 59 溶剂准备 过滤 60 选择合适的滤膜 聚四氟乙烯滤膜 适用于所有溶剂 酸和盐 并无任何可溶物 醋酸纤维滤膜 适用于水基溶剂 不适用于有机溶剂 推荐用于蛋白质和其相关的样品 尼龙66滤膜 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液 可用于强酸 70 乙醇 二氯甲烷 不适用于DMF二甲基甲酰胺再生纤维素滤膜 具有蛋白质吸收低 同样适用于水溶性样品和有机溶剂 注意 1 每张滤膜只能用一次 2 水相和有机相不要搞混 61 溶剂的相溶性 62 溶剂信息 避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂 卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液 高浓度的无机酸例如 硝酸和硫酸 能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物 含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂 在有机溶剂中的有机酸溶液 含有强络合剂的溶液 四氯化碳和异丙醇或THF混合液 63 溶剂截止波长 64 背景吸收的影响 背景吸收降低了线性范围多数流动相有紫外吸收 65 MeOHvs ACN ACN与MeOH比较粘度低洗脱强度高UV吸收低空气溶解度小比甲醇更毒价格高低pH下对碱性物质分离度更好 高pH下甲醇更好易产生鬼峰溶剂化效果更好化学差异更大对盐的溶解能力差 结果峰型尖锐 压力低 磨损小出峰早 试剂消耗少低波长检测基线波动小对分析人员危害大运行成本高峰型尖锐干扰大更适合于离子交换色谱选择性更好易产生沉淀 堵塞系统 66 溶剂准备 脱气 67 流动相使用前为什么要脱气 流动相使用前必须进行脱气处理 以除去其中溶解的气体 如O2 以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时 因压力降低而产生气泡 气泡会增加基线的噪音 造成灵敏度下降 甚至无法分析 溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化 柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能 若用FLD 可能会造成荧光猝灭 68 常用的脱气方法比较 氦气脱气法 利用液体中氦气的溶解度比空气低 连续吹氦脱气 效果较好 但成本高 加热回流法 效果较好 但操作复杂 且有毒性挥发污染抽真空脱气法 易抽走有机相 超声脱气法 流动相放在超声波容器中 用超声波振荡10 15min 此法效果最差 在线真空脱气法 LC真空脱机利用膜渗透技术 在线脱气 智能控制 无需额外操作 成本低 脱气效果明显优于以上几种方法 并适用于多元溶剂体系 69 典型的流速 70 流动相的保存 有机溶剂流动相 室温下密封 避光保存缓冲盐流动相 当日现配现用低温下密封保存 一般不超过3天防止长菌有机溶剂与水 缓冲盐 混配的流动相 低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器 71 保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水 测试条件水样 40mltraceenrichment 2 0ml min色谱柱 C18反相柱 Waters 梯度 线性100 水 100 乙腈波长 254nm 72 色谱柱日常使用 过滤所有的溶剂和样品使用保护柱不要把柱接头上得太紧 损坏接头螺纹易渗液开机时 流速和柱压要逐渐增加进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液注意色谱柱的pH值使用范围不要高温下过长时间使用硅胶键合相柱子关机前先用水冲洗整个系统 移走缓冲液后再用有机相冲洗不要高压冲洗柱子 73 色谱柱保护 74 在线的保护装置 给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱新型保护柱 75 新型的保护柱 特点高质量 高效填料 不损失柱效增加分析柱效 增加适应范围20mm柱长 脏样品载荷能力大 能延长保护柱寿命手可拧紧接头 安装时不需要工具通用柱套 适用于所有的HPLC柱 3 9及4 6内径 整体式 使用方便 容易各种不同填料配合色谱柱 76 色谱柱常见毛病 两次保留作用 分叉色谱峰柱压过高多少才算高 不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低重复性差不出峰 回收率低 77 峰型 双峰 柱塌陷 柱中有死体积 过滤片部分堵塞 只有一个双峰 组分的共洗脱 可能原因 样品与溶剂不匹配 溶剂与柱子不匹配 78 两次保留作用 分叉色谱峰 1 酸碱化合物的分离 选择封端的色谱柱2 合适的缓冲盐或离子对试剂 配置合适的浓度3 合适的流动相PH值 日常分析必须准确调节流动相的PH4 正确的流动相组成5 合适的样品浓度6 防止色谱柱机械震动和干枯产生裂缝 79 普通反相HPLC柱 C18 的性能 传统C18填料的稳定性硅胶基质填料pH范围 2 8pH值大于7时键合相粉碎或溶解pH值小于2时键合相的化学键断裂经常用缓冲液固定相降解 80 常规硅胶柱 封端硅胶柱 封端色谱柱减少了二次保留作用 酸性硅胶基体 酸性较弱的硅胶基体 81 柱压过高 为什么柱压会过高微粒堵塞样品流动相密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长 82 柱效低 为什么柱效低色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品 流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯 83 重复性差 回收率低 实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低 不出峰 不可逆 吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附 84 色谱柱的日常清洗 对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 如反相C18柱用100 甲醇或乙腈 硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质 再用干燥的二氯甲烷 正庚烷100 200ml依次活化键合相柱 烷基 的一般方法20倍柱体积的 甲醇 氯仿 甲醇 水依次冲洗柱子尺寸柱子体积冲洗体积150 x4 6mm2 5ml50ml200 x4 6mm3 3ml65ml250 x4 6mm4 2ml80ml 再有杂质严格清洗 20倍柱体积的水 相同体积的0 05mol L硫酸 最后用水 流动相清洗 85 色谱柱的清洗 物理阻塞 在安装柱前后测试压力差如果柱压力太高 反装色谱柱 并用10 20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱 监测压力变化若出现沉淀 如 蛋白凝聚 细胞物 聚合物 设法用相应的可溶性溶剂 如0 1 TFA 80 乙腈 6M盐酸胍 THF HFIP若仍无效 应考虑更换过滤片 86 色谱柱头塌陷的修补 柱头有塌陷可用填料修补 1 松开柱入口接头 拆下不锈钢烧结过滤器 常见柱头塌陷 剔掉无规则床层和带色填料 使柱床呈白色水平面 滴一滴甲醇 加少许填料使沉降 如此反复多次后 用刮刀将填料刮平 放上清洗过的不锈钢烧结过滤器 装上柱入口接头 把柱重新接到LC仪器上慢慢地增加流速 直到操作上限为止 2 如果柱头塌陷较深 小于1cm 可逐渐减低流速至零 再次拆下柱子 用填料修补直到塌陷填满为止 87 色谱柱的存放 存放前的处理除去杂质 盐等 防止细菌生长 合适的存放溶剂两端密封保存 避免色谱柱床干枯避免机械震动注意存放的温度 88 色谱柱以外的因素 一 柱效 问题 不一定是色谱柱问题 仪器问题 连接不好造成死体积进样器检测器管路 连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题 色谱柱未平衡好进样量太大 89 色谱柱以外的因素 二 柱压过高问题 不一定是