第五章 菌种的生产

第五章 食用菌菌种的生产,菌种制作是食用菌栽培的前提,纯度高、生命力强的菌种是获得丰产优质的先决条件。虽然食用菌的孢子相当于植物的种子，但食用菌主要通过菌丝体作为“种子”进行播种，因此，食用菌菌种生产有特定的制种程序。,第一节 菌种生产流程及设备,一、菌种的类型（一）菌种分级和类型 菌种（spawn）：是指以保藏、试验、栽培等用途为目的，具有繁衍能力，遗传特性相对稳定的菌类的孢子、组织或菌丝体及其营养性或非营养性的载体。 通常所说的菌种是指生产用菌种，即以适宜的营养培养基为载体进行纯化培养的菌丝体，也就是培养基质和菌丝的联合体。,1、菌种的分级,（1）母种（mother culture）:又称为一级种或试管种，是用各种方法（孢子分离法或组织分离法）等分离到的纯培养物，移接到试管斜面上培养而得到的纯种。是生产其它类型菌种的原始种。 采用分离法得到的母种数量有限，可进行转管繁殖，得到更多的母种，称为再生母种，可用于生产用种或保藏，通常将一支试管母种可移接成10多支再生母种。,（2）原种（primary spawn, stock spawn）:是由母种扩大培养而成的菌种，是母种和栽培种之间的过渡种。又称为二级种。 原种可采用750mL菌种瓶或500mL罐头瓶作为培养容器。一支母种可扩繁成6-8瓶原种。原种是在栽培季节前1-2个月提前制备以供生产需要，对原种要绝对保证纯度，不能有污染。也可用于小规模栽培。,（3）栽培种（culture spawn）:,又称为三级种，是由原种进一步扩大繁殖而来。直接用于生产用种接种到栽培袋、菌床或段木上进行栽培，通常一瓶原种可繁殖30-50袋栽培种。用聚乙烯塑料袋或玻璃瓶培养。,2、种型,按培养基主料划分（1）木屑种：指以适宜木腐菌生产的木屑作为培养基主要原料生产的菌种，木生食用菌的二级种和三级种常用这种种型生产。（2）粪草种：指以适宜草腐菌生产的粪草作为培养基的主要原料生产的菌种。 （3）麦粒种: 指用麦粒作为培养基生产的菌种，营养丰富，菌丝生长好，生命力强，播种速度快，产量高，易污染。常用作二级种。,二、制种的基本设备,1、母种生产的设备和试剂2、配料设备：切片机、粉碎机、过筛机、搅拌机3、灭菌设备：高压灭菌锅、常压灭菌灶、电热干燥箱4、接种设备：无菌室、接种箱、超净工作台5、培养设备：恒温箱、培养室,三、菌种厂的规划与布局,（一）基本原则1、以销定产、设备配套：根据当地发展食用菌的种类、资源和销售行情，确定菌种厂规模的大小，按每年各季生产菌种量规划厂房各部分的面积，并以此来选择设备的不同型号和台数。2、根据实力确定制种级别：根据拥有的技术力量和设备条件确定生产菌种的级别。,（二）菌种厂的布局,1、布局原则：（1）设在交通方便，能源便利，水源干净、空气清新、利于排水的地方。（2）制种工艺过程要节约劳动力，适应流水作业。,2、简易菌种厂的布局：适宜乡村，年生产量10万瓶以内。,菌种贮存室,培养室,培养室,培养室,冷却室,缓冲室,接种室,拌料、装料室,灭菌室,煤厂,仓库,晒场，菌瓶堆放处,第二节 培养基配制及菌种分离培养,一、培养基的类型按营养成分划分：1、天然培养基：由化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物配制而成的培养基。2、合成培养基：是用已知化学成分的有机或无机化学药品配制而成的。3、半合成培养基：是用成分未知的天然物质和成分已知的物质共同配制而成。,二、培养基配方,1、母种培养基：PDA：多用于菌种分离、培养和保藏，培养木腐菌不需调pH值，猴头例外，需加苹果酸或乳酸调至4.5。培养草腐菌需用1%的氢氧化钙调至7.5。,2、原种和栽培种培养基,（1）木屑培养基：将木屑等干培养料加水120%-130%，充分拌匀，使其含水量在55%-65%之间，用手所握水分“悬而不滴”，装料时注意松紧一致，装量以瓶高的2/3或3/4为宜，上表面压平压实，中间用锥形木棒打孔至底部，清洗瓶口内外，擦干加棉塞，包牛皮纸，灭菌。,（2）麦粒培养基制作：新鲜小麦用清水浸泡4-6小时，加火煮至麦粒中心无白心且外皮不破，沥干水分，加碳酸钙拌匀，装瓶，加棉塞，包牛皮纸，灭菌。,三、菌种的分离（spawn isolation）,人工栽培的食用菌菌种，最初都是来自于野生的食用菌经分离得到的。无论是人工栽培还是野生环境，在自然状况下，菌体表面和周围环境都存在大量的霉菌、细菌等微生物，为了获得高纯度的菌种，需要采取一定的技术措施，将所要的食用菌从微生物菌群的包围中分离出来，分离方法主要有：孢子分离法、组织分离法、基内菌丝分离法。,（一）孢子分离法(spore isolation)：,在无菌操作条件下使孢子在适宜的培养基上萌发，长成菌丝体而获得纯菌种的方法称为孢子分离法。1、种菇的选择：选择群体生长势强的优良个体，特征典型、成熟度适当、无病虫害。,2、孢子采集法,（1）孢子弹射法：整菇插种法：适用于伞菌类。需用孢子收集器来收集孢子，将钟罩上的孔加上棉塞或包上纱布，放在垫有4-6层纱布的瓷盘上，纱布上放一培养器，内放不锈钢支架。收集器先灭菌备用。将成熟子实体洗净，表面消毒后，按无菌操作要求移入收集器，插在支架上，适温培养。2-3天后孢子散落在培养皿中，加入无菌水，吸取孢子液，接种在培养基上。,三角瓶钩悬法：适用于无柄子实体。将新鲜成熟的耳片用无菌水冲洗后，吸干，挂在灭菌的钩子上，适温培养24h。取出耳片后，继续培养。试管贴附法：取小块成熟的菌褶或小块菌盖，用溶化的琼脂贴在试管斜面上方或皿盖上，6-12小时后，将培养基移至新的无菌培养皿中培养。,（2）菌褶涂抹法：将伞菌子实体表面消毒后，用接种环在两片菌褶间，轻轻抹过，划线法涂于培养基上。 （3）孢子印分离法：将伞菌子实体表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下置于纸上，静置一天，待形成孢子印后，移取少量孢子培养。,（二）组织分离法（tissue isolation）,是利用子实体内部菌肉组织来获得菌种的一种最简便的方法，是生产上常用的一种分离菌种的方法。（1）子实体组织分离法：将种菇用无菌水冲洗后，表面消毒。用刀片从菌柄或菌盖中部纵切开，挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织，接种到培养基上培养。（2）菌核组织分离法：茯苓、猪苓（3）菌索分离法：密环菌、假密环菌,（三）菇木分离法（mushroom-wood isolation）,是利用生长过子实体的组织内残存的菌丝体进行分离获得纯菌种的方法。银耳菌种常用此法。用长有菌丝的段木来分离可同时得到银耳菌丝和香灰菌丝。 在子实体发生季节采集菇木，风干后进行分离。取菇木的中间部位，切成2cm3左右小块，表面消毒后，接入培养基上培养，长出白色菌丝后，挑取尖端转接可得纯培养。,四、菌种的培养,（一）培养条件 母种在培养箱中培养。原种和栽培种接种后立即放入培养室内。在培养过程中要对温度、湿度和空气进行调节。,1、温度,温度太高菌种早衰，太低生长缓慢，延长生长周期。因此，保持适宜的温度非常重要。大部分食用菌菌丝体适宜在25左右生长。（1）升温：随菌丝生长量增加，菌丝自身发热渐强，升温应随菌丝量增加而降低。以最适培养温度为基准，每5天降低1度，室温应控制在菌种最适温度下2-3度。 （2）降温：在高温季节要降温。遮阴、喷湿，同时要加强通风。,2、通气条件：培养室内要有通风窗或排气扇。培养架不宜过挤，菌种瓶摆放要疏松些。3、湿度：在雷雨季节要通风降湿，可在室内撒石灰吸潮；湿度不够时，喷水增湿。4、光线：避光培养。,（二）防止杂菌污染,1、严格选择菌种2、灭菌要彻底3、接种严格熟练4、创造最佳培养条件,（二）原种和栽培种鉴定,1、菌种传代和菌龄应在规定的范围内，菌龄一般在3个月内有效。2、外观要求长满培养基菌丝生长健壮色泽符合该菌类菌丝特有的色泽。无杂菌污染菌种不老化，没有黄色分泌液观察是否瓶壁分离,3、菌种选购的方法：提、闻、看、（纯正壮阔）4、菌种的退化和老化：退化（degeneration of spawn）:是指菌丝活力和生产性能突然或逐代降低的遗传现象。是自身发生的遗传性变异，更加适应人工培养环境。多次移接造成的。老化：是由于菌龄太长或营养不足、环境不适、保存不好引起菌丝生活力降低的生理现象。表现为生长缓慢、菌丝倒伏、颜色变黄。,菌种复壮（rejuvenation of spawn）:使生活力和丰产性能降低的菌种，恢复或提高到原有健壮程度。单胞分离高剂量的紫外线和低剂量的NTG联合处理退化菌种改善栽培条件，如更换培养基无性繁殖和有性繁殖交替使用,菌种保藏（spawn preservation）:根据菌种的遗传性能和生理生化特性，人为地创造环境条件，使优良菌株稳定地保存。原理：低温、缺氧、干燥，使生长受抑制，延缓代谢速度，生命活动处于休眠状态，减少变异的发生，以保持菌种的纯正，防止死亡和衰退。方法： 斜面冰箱保藏法（slant storage at refrigerator temperature） 矿油保藏法（storage under mineral oil） 滤纸保藏法（spor