与肌肉代谢和结构有关的不同肉质表型识别基因的猪种间的肌肉转录组比较.doc

与肌肉代谢和结构有关的不同肉质表型识别基因的猪种间的肌肉转录组比较摘要背景：肉的品质取决于发生在肌肉组织中的生理过程，这可能会涉及到一系列与肌肉结构和新陈代谢特性有关的基因。了解在屠宰过程中肉类表型之下的生物现象对揭示肉品质的变化是必要的。因而，要对肌肉转录组进行分析，比较两个高对比度猪品种（长白（LW）和巴斯克（B）的基因表达图谱，可以知道不同的饲养环境会影响到肉的品质。LW是养猪业中占有优势的品种，这不利于肉类质量属性的标准的设定。B 是以低瘦肉、高脂肪含量、高肉质为特性的本地品种，该品种从遗传学的角度与欧洲其他的猪品种相距甚远。方法论/主要发现：进行转录组分析使用一个自定义的15k微阵列，突出了不同品种之间表达有差异的1233个基因（使用=0.05多重检测），其中的635个在B品种中高度表达，598个在LW品种中高度表达。在不同的饲养环境中基因的表达没有不同。另外，12个差异表达基因的表达水平被实时RT-PCR验证微阵列数据量化。集群功能注释强调了与转录品种差异有关的四个主要集群：代谢过程、骨骼肌结构和组织、细胞外基质、溶酶体，蛋白质水解。从而，突显出与肌肉生理和肉类品质变化有关的许多基因。结论/意义：总之，这些结果将有助于更好地了解肌肉生理和肉品质变化潜在的分子和生物过程。另外，本研究是识别猪肉品质的分子标记和调控手段后续发展的第一步。引言 因市场对瘦肉的需求日益增长,故引导猪的繁殖计划向获得现代肉用型猪发展。有目的通过增加日增重和胴体瘦肉率来提高猪生产性能的同时也提高了猪的生长速率、饲料转化率、瘦肉含量和腰眼面积的增长，减少了背膘厚和胴体脂肪含量。然而，消费者对猪肉的评价中扮演重要角色的一些肉品质性状，比如系水力、颜色、PH、肌内脂肪含量和嫩度也受到影响。影响肉品质的因素是复杂的，它依赖于猪的基因型、环境条件、宰前处理、屠宰过程。此外，肉品质的变化取决于发生在肌肉中的生理过程，这个过程涉及到许多与肌肉结构和代谢特点有关的基因 。弄清楚肌肉品质性状有不同的选择和非选择品种间的转录组表达谱差异，可能有助于理解肉品质变化的生理过程。 为了这个目的，设计该实验研究在胴体脂肪含量和肉品质方面有鲜明对照的两品种(LW和B)猪的背最长肌的基因表达谱。LW在现代养猪业中是最有优势的品种，它以高瘦肉率、低脂肪含量和高日增重为特点，但有标准的肉品质。相比之下，B是本地的品种，以低瘦肉率和高脂肪含量、高肉品质为特点,它从遗传学角度来说与其他欧洲的猪品种相去甚远。此外，尽管越来越多的出版物关注基因表达与猪肉质量的关系，目前的转录组分析是第一个从事对高肉质量的B品种的研究。 我们研究的目的是探讨LW和B两种猪与肌肉性状和肉品质方面有关系的LM转录组谱，从而阐明文献报道中导致这两种猪产生巨大表现差异的生物现象和提高我们对肉品质的综合判断。这两种猪要么在可选择的饲养条件下饲养（A，室内圈养和室外散养；n=10），要么在传统饲养条件下(C，全漏缝地板，n=10)，研究表明不同的饲养方式已经影响了一些肌肉和肉品质的性状。 为了获得关于基因表达图谱的精确信息，转录组分析时使用了一种新的、特定的猪肌肉微阵列，即15K Genmascqchip，其中85的探针与一个特定的注释序列和9169个特定基因相关。对基因本体论生化过程和功能注释集群的功能分析正在进行，来突出生物网络和肌肉生理、肉类品质相关基因的密切关系。结果增重、机体组成和背最长肌特征如表所示，B和LW两个猪品种在增重、机体成分、最长肌组成、生物物理特征和肉的感官性状上表现出很大的不同。由于B的日增重低，要达到相同的体重，B比LW需要更长的时间（85天），同时表现出更高的背膘厚（75）和更低的腰肌比例（230）。在LM组成上，B的含量水比LW稍高，而总的蛋白质含量基本相近。LM的胶原蛋白含量和糖酵解潜力比B高，但肌内脂肪含量（251）比B低。LW也表现出高的滴水损失和剪切力，低嫩度、香味和多汁性。饲养环境对增重、机体成分、LM组成和生物物理特征没有显著影响。A饲养环境中肉的嫩度比C饲养环境要低（4.0 vs.4.4, P= 0.018），但多汁性和香味并没有什么不同。转录分析用定制的15K骨骼肌猪微阵列（Genmascqchip）进行B与LW肌肉转录组的比较，该微阵列可以通过基因表达综合平台公开利用，编号为GPL11016。简单说，这种新的猪的骨骼肌微阵列能被很好的注释（超过70%），从而可以研究与8622个人类Entrez Gene ID相对应的9169个独特的基因。基于网络的基因集分析工具包主要用于针对生化过程的基因本体论分类。GO-slim（代表高水平基因本体论）用于聚焦最重要的过程。如图1所示，13个生化过程十分突出。其中代谢过程是最重要的一类（涵盖50%的基因），而增重过程仅涵盖不到5%的基因，仍有20%左右的基因没有归类。 通过对饲养在两个不同的饲养环境中（C, n= 10每种和A, n= 10每种）的两个品种（B, n = 20和LW,n =20）进行转录分析来比较它们肌肉表达谱的差异。LW的基因表达并没有因为饲养环境的变化而发生改变，因为在A与C猪中没有发现差异表达探针。相比之下，我们观察到一个对基因表达有影响的优良品种，有12%的探针在B与LW品种间表达是有差异的（P0.05）。基因表达在品种间显示出显著的不同，这些品种可以根据叠化值分为两列。叠化值可以通过当基因在B品种高度表达时B与LW样品表达比率来表示或是通过当基因在LW品种高度表达时LW与B样品表达比率来表示。差异表达基因与1223个独特的注释基因有关，其中635个基因在B品种高度表达（表S1），而598个基因在LW品种高度表达（表S2）。详细的基因名称、描述、识别、叠化值和适当显著水平的BH值，在表S1和表S2中有具体说明。如果有冗余（每个基因有超过一个探针），则叠化值总是与和微阵列数据高度一致的探针集相似。显著差异表达（FC2）和丰富的信息性（至少有一个相关的GO BP term）都在表2中说明，表2中的基因是在B品种中高度表达的（2FC=2.6），表3中的基因是在LW品种中高度表达的（2FC=5）。B品种中在最长肌上高度表达的15个基因中，有四个参与了脂质代谢：磷脂酶A成员A1 (PLA1A)、蛋白质脂肪酸转移酵素亚族(FNTB)、鞘磷脂磷酸二酯酶酸类似物3A (SMPDL3A) 、激素敏感脂肪酶 (LIPE)。这四个基因参与转录或翻译：锌指蛋白410、锌指蛋白24、细胞质聚腺苷酸化元素相关蛋白2、角蛋白和型细胞骨架7。还有三个基因参与离子转运或离子体内平衡：线粒体的钠氢交换、钙离子激活通道钾离子交换、液泡融合蛋白MON1同系物A。LW品种中在最长肌上高度表达的26个基因中，有6个基因参与了转录或RNA的生成：锌指蛋白7、RNA聚合酶相关蛋白RTF1、干扰素调节因子8、LSM3同系物、去乙酰化酶3和锚蛋白重复域1。5个基因参与防御、免疫系统或应激过程：白介素10受体亚族、谷胱甘肽过氧化物酶8、天冬酰胺合成酶、干扰素调节因子8和锚蛋白重复域1。有4个基因参与了氧化还原过程：aldoketo还原酶1族成员B1、谷胱甘肽过氧化物酶8、metaxin 3、乙醛酸盐还原酶/羟基丙酮酸还原酶。最后，有3 个基因参与了葡萄糖的代谢过程：葡萄糖磷酸变位酶1、溶质载体5族成员4、乙醛酸盐还原酶/羟基丙酮酸还原酶。通过定量RT-PCR验证基因芯片分析在差异表达基因中，选出12个通过实时定量PCR来验证微阵列差异表达结果。其中6个基因在LW中高度表达（ADAMTS8, SPARC, GLOD4, ANKRD1, HHATL 和 IGF1），6 个基因在B中高度表达（LIPE, ZNF24, FOS, FABP3,PPARD 和FHL3），在微阵列分析中FC的扩展值在1.24.3之间，RTPCR分析也是这样。结果见图。用RTPCR的方法，所有12个基因在两品种间表达有差异，使用两种方法，如微阵列和RTPCR，每一个基因的FC值是相似的。品种间差异表达的功能分析 这两列基因，在B中高度表达的635个基因和在LW中高度表达的598个基因，使用了注释数据库进行基因本体BP富集分析，该数据库包括可视化和集成发现生物信息资源。重要结果（显著性水平P=0.05）见于表4。与脂质代谢和运输、碳水化合物代谢和运输有关的基因本体BP，富集在B中高度表达的基因列表。而生物吸附、蛋白质聚合趋化和细胞骨架组织有关的基因本体BP，富集在LW中高度表达的基因列表。为了减少冗余并研究一个网络格式中的功能相关基因，使用DAVID工具完成了功能注释集群。为在B（表5）中和LW（表6）中高度表达的基因列表，我们使用三个基因本体论术语、BP、细胞元件（CC）、分子函数（MF）、BIOCARTA和关于基因、基因组的KEGG 20等方法建立了一个功能相关集群的生物模块。根据黄等人的研究，一个相当于P=0.05的非对数标尺的富集数据1.3，已经用于集群意义的阈值来使用。在B中高度表达的基因列表中，发现有6个改进群有超过1.3的改进数据。根据功能把基因分为3个群：细胞骨架基因（集群1-B）、液泡和溶酶体（集群2-B）、葡萄糖代谢过程（集群4-B）。其他三个集群（集群3-B、5-B、6-B）与转录过程有关。在LW中高度表达的基因列表中，确定了8个集群，它们与细胞外胶原蛋白（集群1-LW, 2-LW和5-LW）、多糖绑定（集群3-LW）、细胞运动（集群4-LW）、收缩纤维和肌动蛋白聚合（集群6-LW and 7-LW）和趋药性（集群8-LW）有关。讨论 在遗传背景上，B品种是欧洲七个国家的11个品种中以“独特”为特点的本地品种。尽管有越来越多的出版物关注基因表达与猪肉品质的关系，本研究是第一个对非选和具有高肉质猪品种的转录组分析。我们的目标是阐明可以揭示文献中报道的B与LW品种肌肉表型差异的生物现象。整个骨骼肌组织的转录图谱显示了一个挑战，即因为基因表达的变化可能会反映出存在于该组织中的各种细胞的mRNA组成的变化。然而，即使我们不能把表达的改变归因于一个特定的细胞类型，我们可以假设肌纤维是主要的一种细胞类型，假设在组织上品种的比较是作为一个整体进行的。在转录组分析之后，LW与B之间的12个差异表达的基因已经通过定量PCR分析完全确定下来了，因此也能证明新的GenmascqChip是一个研究猪的基因表达的功能强大的工具，从而可以更好地理解肌肉生理。 从遗传背景方面比较骨骼肌基因表达的差异，仅有这些研究数据是远远不够的。本研究中两品种间差异表达的基因数目与文献记载的数量相同。在B与LW品种中基因表达的高度差异是均衡的，各自有635和598个基因高度表达，这表现出在生长性能、骨骼肌特点和肉品质性状上的优良品种差异。特别是，与LW相比B具有较低的瘦肉率和明显的高脂肪含量，这和之前B与LW在增重、胴体、肌肉特点和脂肪组织代谢上的比较一致。为了在相同的时间和体重宰杀两种猪，因为B品种生长速度比较慢，所以B品种提前两个月开始实验，在屠宰时B品种猪比LW品种猪大三个月。此外，为达到给定活重两品种饲喂相同数量的饲料，然而LW的潜在增长速率和食欲比B要高。因此，品种、年龄和饲养的影响是复杂的。相反，LM基因表达图谱在A和C饲养环境是没有区别的。因此，饲养环境不会影响LM组成、生物物理特点和肉的品质，但会影响肉的嫩度。这与之前的对比研究不同，从而可以确认动物对不同饲养环境的反映取决于基因型、环境条件等。此外，饲养环境间嫩度的差异比品种间的要低。这也支持这个理论，即一般基因型对肌肉特性的影响要比饲养环境大，特别是对高对比性品种来说。然而，我们不能排除屠宰条件可能会掩饰宰前饲养环境的影响。 LW和B之间的差异表达基因的功能分析突出了与品种差异有关的四个主要相关生物网络：代谢过程，细胞骨架和收缩纤维，细胞外基质，液泡、溶酶体和蛋白质水解。我们将会就肌肉生理和肉类品质方面对每一类别中的一些基因进行讨论。叠化值可以用当基因在巴斯克品种高度表达时，巴斯克（B，n = 20）和长白（LW, n = 20）样本的表达率来表示；也可以用当基因在LW品种高度表达时，LW和B样本的负表达率来表示。Benjamini和Hochberg使用适当的显著性水平分析微阵列数据，Student使用t-检验分析qPCR数据，通过这些说明其统计学意义。ADAMTS8（金属蛋白酶域蛋白8），ADAM金属肽酶、血小板反应蛋白1型模序8；ANKRD1，锚蛋白重复域1；FABP3脂肪酸结合蛋白，心脏；FHL3（细胞增生症3），4.5LIM域3；FOS（低聚果糖），FBJ鼠类骨肉瘤病毒致癌基因同系物；GLOD4，乙二醛酶域内含4；HHATL，刺猬酰基转移酶类似物；IGF1，胰岛素样生长因子1；LIPE，激素敏感脂肪酶；PPARD，过氧化物酶体增殖物激活受体；SPARC，分泌蛋白质酸、富含半胱氨酸；ZNF24，锌指蛋白24.代谢过程 富集分析揭示了与脂质代谢过程和脂肪酸转运过程有关的基因更多地在B品种表达。B品种中更高的肌肉脂肪酸结合蛋白和肌内脂肪含量证实了这样一些研究，即这些基因对猪肌内脂肪沉淀的控制作用是备用的途径。在B品种中，ACACB（乙酰辅酶A羧化酶）的高度表达可以认为脂肪酸转化过程中的限速步骤，发现乙酰辅酶A羧化酶在B的肌肉中有更高的活性，Alfonso等也这样认为。然而，即使B品种会沉淀更多的肌内脂肪，也需要更多的脂肪维持生命，还依赖于脂肪的氧化和分解来维持基本的新陈代谢。确实，与线粒体氧化脂肪酸有关的PPARD（过氧化物酶体增殖物激活受体）、SLC25A20（肉毒碱/酰基肉碱移位酶，它能调节酰基肉毒碱运输到线粒体基质进行氧化的过程）和ETFDH（电子传递黄素蛋白脱氢酶）在B品种中有更高的表达。在脂类分解上，在B品种高表达基因列表中，富集功能分类的脂类分解过程中发现PPAP2A（磷脂酸性磷酸酶2A型）和LIPE。PPAP2A在脂类的水解和细胞外摄取过程中扮演了一个重要角色，而且已经发现，LIPE在金华肥肉中比精瘦的长白猪中有更高的表达。总之，这表明一个较高的脂肪酸变化量（包括转移、合成和分解）可以解释品种间在肌内脂肪含量上的差异。然而，调查是建立在整个肌肉组织的基础上，我们不能排除B品种中大量的脂肪细胞也会调节两品种间基因表达的差异。最后，B品种中最长肌性状上低的SPARC（分泌蛋白质酸、富含半胱氨酸）的表达与它的高的肌内脂肪比例相一致，这也暗示这些基因在肌内脂肪含量的控制上确实起到了一定的作用。SPARC已经证实可以抑制脂肪合成，不含SPARC的老鼠发现比野生型的老鼠表现出更强烈的脂肪沉淀。 功能注释集群（集群4-B）和富集分析都表明葡萄糖代谢过程对B品种最长肌的特点是很重要的。在这些集群中，AGL（糖原脱支酶）和PHKB（磷酸化酶激酶）负责完成糖原降解过程30,31。这也许暗示B品种使用糖原来维持肌肉的新陈代谢，而LW尽量节省糖原从而可以解释LW有高的肌肉糖蛋白。然而，PGM1（葡萄糖磷酸变位酶1）、GAPDH（甘油醛3磷酸脱氢酶）和LDHA（乳酸脱氢酶A）的含量在LW中是上升的，这表明LW品种也依赖葡萄糖来满足它们的能量需求。家养的猪与野生猪相比一般具有更多的糖分解、更少的肌肉氧化代谢，而LW品种糖酵解途径相关基因高度表达。 最后，肌酸激酶对于维持肌肉细胞中的ATP/ADP比率和调节肌肉收缩时能量的可用性是一种必要的酶。LW品种中（肌酸激酶B链；细胞质）和B品种中CKMT2（肌原纤维节线粒体肌酸激酶）的高度表达，暗示了LW品种在肌肉收缩时迅速的糖分解ATP生成过程，而B品种会将线粒体生成的ATP通过CKMT2转移到肌纤维中，从而反映了一个更大程度的肌肉氧化代谢过程。此外，也可暗示细胞质肌酸激酶是猪肉滴损失的备用的蛋白质标记，CKB在LW中更高的表达，LW表现出更高的滴水损失。因此，细胞质肌酸激酶蛋白质含量确实与肉的亮度meat lightness有关，它随drip滴数而增加。细胞骨架和收缩纤维 功能注释集群分析中的三个集群，B品种组织的集群B（细胞骨架）、LW品种的集群LW（收缩纤维）和集群LW（肌动蛋白纤维组织），揭示了骨骼肌组织和结构的重要特征，可以用于描述品种间基因表达图谱的差异。肌动蛋白的细胞骨架参与了许多细胞过程，但肌动蛋白动力学、细胞骨架组织和肌肉变化的关系仍不清楚。有趣的是，ABRA（肌动蛋白结合Rho激活蛋白，也叫做STARS，Rho信号活化剂）在B品种的背最长肌上高度表达。ABRA可以激活血清因子、诱导基因在骨骼肌中的表达加强，从而有助于B品种中转录的增加（集群5-B和6-B）。同样的，在B中表达差异最大的基因，也是一个可以促进肌生成的转录因子。因此，ABRA和FOS都可能与B品种中观察到的高转录活性有关（集群3-B, 5-B和6-B）。除了转录，ABRA还与骨骼肌的萎缩和肥大有关。在该细胞骨架集群中，我们还发现了ABLIM2（肌动蛋白结合LIM蛋白质家族，成员2），它被认为是与ABRA一起发生作用。因此，我们可以假设，ABRA和ABLIM2可以控制B品种肌肉的变化，也可以维持细胞骨架的完整性。LMOD2（平滑肌蛋白2）可以与肌动蛋白丝相互作用提高细丝的伸长度，而细丝的长度可能在B品种中有更高的表达。这会使得肌节更长，从而增加该品种肉的嫩度，因为肌节的长度可能与肉的嫩度有关。而且，因为短肌节的肌肉通常表现出高滴水损失，LMOD2的高度表达可能降低B品种的相关滴水损失。此外MYOZ1也叫calsarcin 2，是横纹肌的一种特定的肌节钙调磷酸酶结合蛋白。钙调磷酸酶介导钙信号，它在骨骼肌的再生和骨骼肌肥大的调节中扮演一个重要角色。通过敲除MYOZ基因的老鼠表明，钙磷酸调节酶活性会被抑制。因此我们假定，和LW肌相比，在B肌肉中MYOZ的高表达与通过降低钙调磷酸酶的活性而减少它们的肌肉块有关。同样地，TRIM63 (三结构域蛋白家族63, 也叫MURF1: 肌肉特定的RING-finger 蛋白-1)被局限于肌节的M和Z线之间，通过基因表达断面图和基因敲除研究看出，它与肌肉萎缩有关。这意味着B比LW有更多的肌肉萎缩，可能与在屠宰时年龄大有关，同时可能导致它们腰肉百分比降低。最后，在这个细胞骨架群中，ZYX（斑联蛋白）是一种涉及张力纤维修复和细胞骨架完整性维护的蛋白，也发现在B品种中高度表达。然而，我们的研究中没有任何关于ZYX和肉滴水损失积极关联的报告。这可以通过不同的实验设计来解释，比如：在Ponsuksili等人在近期的研究中，比较了F2代中品种与最大滴水损失的关系，表明ZYX和肉品质间的关系有待进一步研究。除了细胞骨架，我们的研究结果强调肌纤维网络的重要性，特别是在B和LW两品种中收缩性肌纤维表达图谱的差异。肌节的主要成分：ACTA1 (肌动蛋白-1), ACTA2(肌动蛋白-2), MYH1 (肌球蛋白重链1, IIx), MYH3 (肌球蛋白重链 3), TPM1 (原肌蛋白1) 和TPM3（原肌蛋白3）在LW中都高度表达，表明在这个品种中，LM是一种表达肌球蛋白重链的稳定的骨骼肌。在这个集群中，NEB(伴肌动蛋白)在骨骼肌中含量丰富，它在薄纤维长度调节、内部肌纤维通联性和钙稳态调节时扮演一个重要角色。此外，Hanwoo牛中NEB的表达与低细脂肪纹路和高剪切力有关，与LW猪比B中NEB表达更多和它们的肌内脂肪含量低、剪切价值高一致。ANKRD1（心脏锚蛋白重复域1，也称CARP）属于这个群，它和肌联蛋白、其他肌纤维蛋白相互作用来维护肌纤维的完整性。他的表达改变了一些情况，如运动、肌肉消耗、营养障碍、应激反应。在心脏，ANKRD1 与CASQ2蛋白相互作用，在肌质网内储存Ca2+和调节Ca2+体内平衡。因此，ANKRD1似乎同时参与骨骼肌的结构和Ca2+的处理，而这两种特有的物质对肉品质具有重要的作用。两猪品种LW肌中ANKRD1的高度表达对肉品质有较大的影响，确定了这个基因与决定肉品质的生物过程有关，这与Ponsuksili等人一致，它暗示ANKRD1是肉品质的一个候补基因。有趣地是，CASQ2 和 ATP2A1 (肌质网Ca2+-ATP酶 1)，它是控制Ca2+从细胞液返回到肌质网的一种蛋白质，都在LW肌肉中高度表达。此外，ATP2A1 突变 和肌内脂肪之间的相关性与肌肉含水量一样，从而推测ATP2A1基因与肌肉的品质有关。总之，现在的研究结果论证了品种之间发现肌肉结构偏差的重要性，从而证明结构蛋白在决定肌肉和肉表型中所充当的角色，甚至保持进一步研究时基因表达与肌肉属性之间的关系。细胞外基质 LW猪的LM的特点是将细胞外区域和细胞外基质的细胞成分浓缩。在这项研究中，这些集群（代表81个基因）显示了浓缩方法最大的成效和统计学的价值，从而揭示了它们的生物学重要性。SPARC 和 SMOC2 (SPARC相关模块化钙结合2)是这些集群中的两个基因，这些集群是在细胞模块相互作用中通过促进矩阵组装和细胞附着力而扮演重要角色的的成员，SPARC是一个参与胶原沉积物的关键细胞外蛋白。因为比品种肌肉胶原含量多，SPARC基因的表达能调节这种矛盾。参与了矩阵组装，它的有针对性的斑块表达强烈地影响了胶原网络，它也与卫星细胞的增殖和分化有关。有趣的是，TGFB受体在相同的集群中发现了，这启发我们这种相互作用能解释LW肌肉的发育。DCN、DPT和的作用方式是一样的，加速胶原蛋白组装成纤维，DST使缺陷小鼠显示疲软骨骼肌 。此外六种基因编码的各种胶原类型在肌中高度表达，与它们高胶原含量一致。因此，相比较品种而言，所有这些生物学过程都与品种的性能一致，这些性能即它们较高的胶原含量、剪切力和柔韧度。液泡、溶酶体和蛋白水解作用 液泡和溶酶体群是在品种中的一个高度浓缩的群。溶酶体包含许多参与胞质蛋白降解的水解酶，即使钙蛋白酶和蛋白酶代表着主要的肌原纤维的水解通路。组织蛋白酶（CTSD）在品种中高度表达，一个CTSD基因的突变与增加日平均供给量、肌肉块和降低在杜洛克猪、猪种的日沉积有关。在这些集群里，我们也发现ATP6V1D（ATPase、转运溶酶体），它是肌肉细胞中将质子从细胞质注入到溶酶体腔的一个液泡副族，这可能调节肌肉细胞中的动态平衡。NEU1（唾液酸酶）作为一个潜在的因子控制骨骼肌中细胞核扩散、胶原蛋白含量和细胞外基质改造，并抑制早期肌生成，这与在猪种发现的低表达一致。也与胶原质编码基因的高表达、肌肉的发育相一致，并可能与肉的低柔韧度有关。利用富集集群分析并没推导出蛋白质的水解功能，但它对肉的柔韧度有非常重要作用。CAST（钙蛋白酶抑素），是在中发现高度表达的一种钙蛋白抑制剂，是参与死后肌肉蛋白水解和肉嫩化的主要蛋白水解酶系统。这就解释了由于较低的蛋白酶水解水平导致的猪的高剪切力和低柔韧度。事实上，CAST将要作为猪品种中一个表示柔韧度的候补基因。蛋白酶复合体系统，对nonlysosomal细胞质蛋白降解起主要作用，它在LW与B间存在较大差异，即在B中2/3蛋白酶复合体连接酶高表达，TRIM63 和 FBXO32 (F-box蛋白质32)在B品种中表达更多。因为蛋白酶复合体将成为有助于检验死后肉柔韧度的一个主要内源蛋白水解系统，这将有利于提高B品种猪的柔韧度。总之，我们研究的目的在于区分文献中报道的B和LW两品种在肌肉生理和肉品质性状的潜在差异的生物学表现。从转录组和功能分析，有四个生物集群被确定了。能量代谢和脂质沉积在基因表达式、化学成分方面与猪品种差异有关。此外，细胞骨架和收缩纤维在肌肉发育、肉的表型方面发挥重要作用。最后，我们的结果启示，细胞外基质是LW肌肉的重要成分，并提高胶原蛋白含量，这可以用来解释肉的柔韧度降低。 总体上来讲，我们的结果有助于更好的理解肌肉生理和肉品质发展的进展。而且，这项研究是朝着肉品质分子标记识别和调控手段后续发展的第一步。方法原理陈述 该实验是根据法国的动物保健指导方针设计的，使用法国高等教育和研究部编辑的有关农业和渔业的规定。所有动物的饲养和屠杀都符合国家规定，并依照被INRA PEGASE法国兽医服务认可的规程来操作。我们研究单位的持有人有法国农业部兽医局颁发的猪实验协议(Nu A35622)。此外，参与实验的技术人员和科技人员有法国兽医局颁发的活体动物实验的个人协议。动物，饲养和屠宰 选择40头已阉割的猪，LW纯品种（n=20，产自9种不同公猪的10窝猪）和土著B品种（n=20，产自6种不同的公猪的10窝猪），它们在两种不同的饲养条件下饲养。平均活重35kg，根据活重和生长速度选择出的2种猪从出生一直饲养到35kg，一种在传统的室内地板饲养（1.0m2/只），另一种可以在室内（1.3m2/只）也可以在INRA-UMR PEGASE的实验农场中（1.1m2/只）散养，然后每个品种的猪分成10只一组，共4组饲养。两种饲养条件的猪以标准的商业饮食饲喂，从35到110kg，每只猪每天2.5kg，当平均体重145kg将要屠宰时，每只猪每天3.0kg。猪分4组在INRA-UMR PEGASE屠宰实验室屠宰，采用电击至晕和放血而死。胴体、肌肉和肉品质测定 记录屠宰的时间、热的胴体重和背膘厚（第4到5腰椎的中间线）。在连接冷却设备24h后，为了计算腰部和背膘比例，要称量新鲜的胴体和右侧的wholesale cuts的。放血死亡30分钟后，认真收集每种猪的一个LMwas样品（胴体一半的右边，最后一根肋骨水平），并立刻在液氮中保存，储存在280uC中直到进行RNA的提取和糖酵解。第二天，采取LM的一个横切片，去掉外部脂肪并剁碎。一半的样品放在真空下，在220uC储存，用于肌内脂肪的测量，剩下的剁碎的LM在测蛋白质和胶原蛋白的成分之前要冻干保存（如前所述）。水含量由之前剁碎的肌肉冻干后的重量确定，用于计算每克新鲜肉中蛋白质和胶原蛋白质含量。为了判断滴度损失，屠宰后从LM（第二腰椎水平）上切下的薄片（1.5cm重量厚）称重后放于塑料袋里在4uC下保存48小时。所有猪屠宰24小时后，从左腰切下的一块，部分消减过的外部脂肪和骨随后的3天要保存在4uC下。依据Honikel在使用Warner-Bratzler细胞适用的一个普通的测试机器判断熟肉剪切力之前，LW要放在真空下冻干，并储存在220uC下。剪切力平均值从每个LM样品的10次测量值中获得。所有猪屠宰后第二天，取一块右腰肉像上面描述的那样准备和储存，直到使用INRA-EASM进行感官分析。10个交易日后评估40个肉尸，每个品种和系统包含4个肉尸。在 4uC下融化48小时后，用火炉煮熟肉（干热250 uC 10分钟，然后湿热100uC约45分钟到核心温度时为8062uC）。然后，中间1cm厚的肉切片剔出12个组，用来检测肉的柔韧度，汁味一个连续的值从0（没有）到10（非常强烈），用统计分析每个样品的每个小组的平均值。 胴体、肌肉和肉品质数据使用方差分析（GLM 程序, SAS 研究. Inc., 卡里, NC），该模型包括品种、饲养条件和互作的固定效应。用最小平方计算每种品种和每个饲养条件。芯片设计 本实验用定制的有15198个寡核苷酸的猪骨骼肌基因芯片。在15198个基因芯片探针中，有12939个探针（即85%的寡核苷酸）已有特定的注释序列，即9169个特定的基因。选择8615k的安捷伦公司的微阵列版本，故在每个幻灯slide上放置8个微阵列，每个微阵列上有一个探针。RNA提取和基因芯片杂交 用Trizol试剂从冻结组织中提取总RNA，使用硅基spin-column纯化。使用安捷伦公司的分析仪电泳设备和紫外光谱法验证了总RNA的质量和浓度。为了比较实验中40个LM的样品，每个样品都要与参考池相比较，参考池有等量的与40个LM样品独立转录本。来自每头猪总RNA分别标有Cy3，参照样品标有Cy5，使用Quick-Amp基因表达和猪肌肉生理PLoS ONE标签工具，并依据其说明书使用。用Agilents SureHyb Hybridization Chambers 进行的基因芯片杂交，每个杂交包含300 ng标记Cy3的cRNA样本和300 ng标记Cy5的参考样本。杂交反应使用安捷伦公司的基因表达杂交工具在65uC下17小时进行。在室温下照片被拆卸并用基因表达缓冲液1清洗1分钟，然后再在基因表达缓冲液2中清洗1分钟。使用分辨率为5 mm/pixel的安捷伦DNA基因芯片扫描仪G2505B扫描，使用安捷伦特征提取软件（9.5版本）分析图像，使用GE2-v5_95_Feb07 FE拟定协议。这些MIAME兼容的基因芯片数据被储存在GEO库，公开加入GEO。序列号为GSE26614。基因芯片数据分析和统计数字 所有的分析都使用2.8.1版本的R软件。基于以下4个标准的原始斑点强度是质量筛选的第一步，4个标准为：强度、均匀性、饱和度、离群值。滤过点的强度转换成log2 (Cy3/Cy5)。使用所有原始数值的所有探针的样本中间值的差集使芯片中的数据标准化，芯片之间使用Limma R方法的Rquantile来获得实验统一的基因表达值。因为整个实验使用相同的红色通道参考，所以用Rquantile方法。为了增加差异表达力的分析，所有被筛选样本中最小表达变异性的斑点使用K均值