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基因治疗及其研究11设农（2）班：涂乔威 学号：1307110222摘要：基因治疗是近20年来随着现代分子生物技术的发展而诞生的新的生物医学治疗技术。利用该技术可将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。从基因治疗（不同于常规治疗）入手，结合国内外的研究进展，概述了基因治疗的概念、现状、存在的问题及其未来的发展前景。关键词：基因治疗；现状；存在问题；发展前景 引言21世纪是生物科学和生物技术的世纪，随着转基因技术、反义核酸技术、RNAi技术等基因操作方法的发展和完善，采用分子生物学手段治疗遗传疾病、肿瘤、心血管和代谢性疾病等已经成为本世纪的一大热点领域。1990年第一例基因治疗的成功使得利用基因工程治疗人类疾病成为现实。目前，基因治疗已成为一项跨世纪工程，越来越多地受到科学界的关注。1.基因治疗的简介1.1基因治疗的概念基因治疗有广义和狭义之分，广义的基因治疗包括了狭义的基因治疗和利用基因药物进行的治疗。而狭义的基因治疗即通常所说的基因治疗，是指通过基因转移技术将外源正常基因直接导入患者病变部位的靶细胞，通过控制目的基因的表达，抑制、校正、替代货补偿缺陷或异常基因，从而恢复受体细胞、组织或器官的正常生理功能，进而达到治疗疾病的一种新型医疗方法。基因治疗在治疗方式上不同于基因工程的药物治疗，但从实际效果看，它是通过导入人体的基因产生特定的生理活性分子而起作用，即相当于向病变部位导入一个给药系统，因此，可将导入的外源基因看作广义的基因药物。故而可推导出广义的基因治疗包括利用基因药物进行的治疗在内。根据外源基因所导入的受体细胞的类型不同，可将基因治疗分为体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。体细胞基因治疗是应用体细胞基因工程技术将外源基因植入人体，进而校正该病人的遗传缺陷。生殖细胞基因治疗是将外源正常基因转入精子、卵子或受精卵，矫正有缺陷的基因而达到治疗你遗传病的目的。理论上讲，生殖细胞基因治疗既可以治疗遗传病患者，又可以使其后代不再患上这种遗传病，是一种使遗传病得到根治方法。1.2 基因治疗实施的具体环节基因治疗的实施包括目的基因和靶细胞的选择及获得，目的基因的导入，外源基因在人体内的高效表达等四个主要阶段。1.2.1特异外源基因的获得随着分子生物学和基因重组技术的发展，基因获取的手段也逐渐成熟。目的基因的获取必须遵循以下原则，即保留基因自身的编码区、调控区和特殊启动子等元件，以保持基因结构的完整性。目前，获取目的基因的主要方法有利用分子生物学手段分离与克隆目标基因，如利用酶切或逆转录等方法，或采用人工手段合成目的基因片段。另外获得目的基因的方法还有：建立基因文库、聚合酶链式反应（PCR）、化学合成法。1.2.2靶细胞的分离与体外培养靶细胞（又称受体细胞）是接受外源基因的细胞，来源于被治疗的对象。基因治疗的实施过程中需要从病人体内选取合适的靶细胞进行体外培养、增值，以获得足够的靶细胞来接受外源基因。合适的靶细胞是基因治疗成败的关键之一，选择是应考虑疾病的性质和部位，取材的容易程度，便于体外培养和遗传操作，以及要有可行的转移方法。目前，T淋巴细胞为较常用的靶细胞。近年来，新生儿脐带血中的干细胞被用作靶细胞，成功治疗了婴儿的ADA缺陷的SCID冰。随着技术的进步，其他类型的细胞如骨髓细胞、角质细胞、肝细胞、皮肤成纤维细胞和血管内皮等也越来越多地用于基因治疗。1.2.3目的基因导入方式基因治疗时应选择适当的基因转移方法，将外源基因转移到受体细胞的细胞核内，使其在染色体上整合或成为不整合的流离基因。随着各种动物基因转移技术的相继问世，目的基因导入的方法也越来越多，为我们所熟知的方法主要有以下三种：1 化学方法：磷酸钙沉淀法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导法等；2 物理方法：包括电脉冲穿透法、显微注射法、基因枪法等;3 生物学方法：如逆转录病毒发（Rt）、腺病毒（Ad）、疱疹病毒（HSV）和腺病毒相关病毒（AAV）载体等。1.2.4 目的基因的表达与控制基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中 能得到高效表达，即产生人们所需要的高产的目的基因工程技术的核心是基因表达技术。基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物.基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录 成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物蛋白质，再在受体细胞环境 中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程。操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用，结构基因开始转录 成mRNA，同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相应的 多肽或蛋白质，转录与转译近乎同时完成，mRNA随之被 水解掉。真核生物基因表达系统中，转录在核内进行，生成hnRNA， 核内加工：剪接内含子和外显子，修饰5和3末端后形成 成熟mRNA。而后在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋 白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。2. 基因治疗的发展现状和存在问题 2.1 基因治疗的发展现状 进行基因治疗必须具备下列条件：选择适当的疾病，并对其发病机理及相应基因的结构功能了解清楚；纠正该病的基因已被克隆，并了解该基因表达与调控的机制与条件；该基因具有适宜的受体细胞并能在体外有效表达；具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用的动物模型。近三年来，已对若干人类单基因遗传病和肿瘤开展了临床的基因治疗。2.1.1 复合免疫缺陷综合征的基因治疗 1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩。采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素（IL2）刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入患儿。大约12月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。2.1.2 黑色素瘤的基因治疗对肿瘤进行基因治疗是人们早已期望的事，在进行了多方面探索的基础上，发现了肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte-TIL,即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞）在肿瘤治疗中的作用。于1992年实施了TNF肿瘤细胞和IL2肿瘤细胞方案，即分别将IL2基因肿瘤坏死因子（tumor necrosis ractor, TNF）基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL2合并用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处，因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。2.1.3 其它遗传病的基因治疗其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快。对于DMD的基因治疗，由于有小鼠动物模型，也取得一定进展。例如1993年法国将Ad-RSVmDys（腺病毒罗斯病毒小肌营养不良蛋白基因重组体）注入小鼠肌内成功。即用腺病毒为载体，与小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因的cDNA重组，在RSV启动子启动下，作肌肉注射，证明可在mdy小鼠肌肉表达，此外，对一些遗传病如血友病，地中海贫血、高雪氏病等正在探索中。 我国复旦大学等单位对乙型血友病的基因治疗也进行了有意义的探索，他们在兔模型的基础上，将人第因子基因通过重组质粒（pcmvix）或重组反转录病毒（N2CMVIX）导入自体皮肤成纤维细胞，获得可喜的阶段性成果，相信不久的将来，基因治疗会在我国取得成功。2.1.4 反义技术 又称反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides）技术，是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制，控制细胞生长在中间阶段,使编码蛋白质的基因能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质，以达治疗某一疾病的目的、用反义DNA已对某些癌症进行临床试验。这类反义技术只能认为是一种从基因水平进行治疗2.2 基因治疗存在的问题日前，除了伦理道德的争议外，基因治疗存在的主要问题是：2.2.1 用于治疗的基因过少 目前在已用于临床实验的治疗基因仅集中于少数基冈，对大多数疾病致病基因有待阐明。这不仅限于致病基因的发现，同时也包括已知和目前未知功能基因的表达调控序列的确定，以及其相互作用规律的阐明，这将有赖于人基因组计划、尤其是功能基冈组学的发展。2.2.2 基因治疗缺乏靶向性基因治疗的关键中的首要问题是能将治疗基冈输送到并进入特定靶细胞，从而要能在该细胞中得到高效表达。2.2.3 载体转移基因的效率，导入基因的持续表达及表达效率的问题日前基阗治疗没有获得满意的结果。目的皋囚在体内不能持续表达和表达水平不高是其重要的影响因素之一。构建转移效率和表达水平均高的载体是今后基因治疗研究的一个重要方向。2.2.4 受体细胞的研究 目前采用的基因标记或基因治疗计划多数采用体外基因转达移方法，但是人体细胞在体外进行长期培养和繁殖，细胞的生物行为是否改变是值得研究的问题。1991年，Rosenberg等采用肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocytes，TIL)基因转移技术治疗肿瘤，这些加T后的r11IL并不像想象那样聚集存肿瘤组织附近，识别并杀伤肿瘤细胞，却大量集结在肝脏和肾脏中，所携带的细胞因子TNF的表达也只有预期的14。由此可见，尽管目前可用于基冈治疗的受体细胞的种类很多，f日在临床应用于中还存在不少问题，必须进一步加强对受体细胞的研究。2.2.5 导入的基因表达缺乏可控性 要使外源基冈能按需表达，最理想的方法是使导入的外源基冈在人体特异组织和细胞中进行长期有效的表达，并能受生理信号的调控。这是今后长期追求的目标，这需要全基囚或包括上下游的调控区及内含子。从近期来说，可以期待实现的是在cDNA水平加一f：部分内含子及调控元件，应用诱导的形式达到一定程度的可控性，这样部分基因，导人体内后，可通过诱导来控制表达。56基因治疗的安全性这是目前基因治疗争论最为激烈的问题比较典型的是1999年美国一位18岁的患鸟氨酸转甲酰酶缺乏症的病人死于基因治疗，主要是由于基因治疗对象选择有误及用药剂量过大；尽管RV载体进入细胞后是随机整合至宿主细胞染色体的，但其仍具有潜在的插入突变可能性。法国几名儿童因采用RV载体进行治疗而患上白血病，再次引起人们时基因治疗安伞性产生怀疑。AAV能优先整合至人19号染色体长臂区段的DNA上，若能弄清楚这种定点整合的机制并证明这种定点整合无害处，这就可以避免随机整合引起插入突变。还要充分估计外源基冈产物对宿主的危害性，当患者体内引入外源基冈后，表达出大量原来缺乏的蛋白质，这可能为引起严重免疫反应，甚至导致有害的自身免疫，这一点也是值得引起重视的。因此，未来如何改造基阗治疗载体，特别是解决逆转录病毒的安全性问题，使之更为安全有效可能是未来基因治疗研究和临床试验的一大热点问题。尽管基因治疗存在诸多问题有待解决，公众和学术界对其也褒贬不一，但我们相信，作为一种对人类健康影响宽广而深远的药物或治疗方式，基因治疗这个年轻的领域正朝着治愈更大范人类疾病迈进，为人类带来了希望，它在遗传性疾病，肿瘤等疾病的治疗上，将产生深远的意义。3. 基因治疗的发展前景基因治疗虽然还存在很大问题，但是总体来说基因治疗技术的发展已取得了巨大成就,它已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在有效的治疗方法。今后基因治疗研究将向两个方向发展：其一是应用基础研究更加深入,以解决基因导入系统和基因表达的可控性研究为主要研究内容，结合人类基因组研究,寻找更为有效的“目的基因”。其二是临床试用项目增多，实施方案更加优化，判断标准更加客观，评价效果更加精确。而且随着人类基因组计划的顺利实施和完成，新的人类疾病基因的发现和克隆，基因治疗研究和应用将不断取得突破性进展。基因治疗研究目前还处于起步阶段，因此现在对它期望过高是不现实的。基因治疗的进一步发展必须借鉴分子病理学、分子遗传学和功能基因组学等领域的最新研究成果。随着相关理论和技术的进一步完善，以及人们思想观念的更新，基因治疗将迎来突破性的进展，第一个基因治疗产品将在未来2-3年内问世，随后将有一批产品进入商品化生产，并迅速形成巨大的市场。基因治疗在临床上将成为一种常规的治疗方法，对某些疾病甚至成为主要的治疗方法，疗效更加彻底的生殖细胞基因治疗将获准实施。可以预见，在不久的将来，基因治疗将为彻底克服遗传病、肿瘤、艾滋病等顽疾，为增进人类健康做出应有的贡献。参考文献：【1】郭永学李楠，仉燕崃，等大孔吸附树脂纯化山楂叶总黄酮T艺研究J中成药，2006，28(1)：23【2】龚青，张叶萍，祝明R