疟原虫显微镜镜检技术

疟原虫显微镜镜检技术,东安县疾病预防控制中心 周永玲2011.07.10,疟疾简介,疟疾是一种古老的传染病,俗称“冷热病”、“打摆子”、“发疟子”、“脾寒”、“瘴气”等，是由疟原虫寄生于人体引起的传染性寄生虫病。,寄生人体的四种疟原虫,间日疟原虫 Plasmodium vivax，P.v三日疟原虫PMalariae,P.m恶性疟原虫 PFalciparum,P.f卵形疟原虫POvale,P.o 我国主要是间日疟常见，恶性疟次之，三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。,镜检疟原虫方法简述,19世纪后期，显微镜的出现使人们不断发现了传染病的病因。1880年法国军医拉韦朗第一次见到并描述了人红细胞内的疟原虫，至此才解开了困扰人们数千年的疟疾的病因之谜。,镜检疟原虫方法简述,目前用于疟疾诊断的实验室检测包括病原学检查、免疫学检测和分子生物学检测三类。镜检疟原虫由于具有操作简便、敏感、价廉和可鉴别虫种等优点，广泛用于疟疾的病原学诊断已愈近一个世纪，仍是目前最常用的方法，也是我国疟疾诊断标准确定的实验室检查方法（WS259-2006）。,镜检目的与意义,疟疾诊断标准中把疟疾病例分为疑似病例、临床病例、确诊病例和带虫者，前两者依据流行病学史和临床表现即可做出诊断，而后两者需通过发现病原体方能做出诊断。通过对发热病人血检达到确诊疟疾病例。及时发现传染源和明确感染的疟原虫种类，以能针对虫种选择正确的治疗方案。,血片镜检,血片制作用于检查疟原虫的血涂片有两种：一种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜。一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。,血膜的制作（取血时间）,取血时机 现症病人一般可随时取血，疟疾普查 时可不考虑取血时机。 在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。间日疟在寒热发作时，外周血液中主要可见环状体期；发作后数小时，环状体发育到滋养体期，疟色素形成，形态较易辩认，为诊断的有利时机；3648小时，可检出裂殖体；发作一、二次后，配子体出现较多。恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20小时内取血，初发患者退热后常查不到原虫。,血膜的制作（取血操作）,取血方法 采血部位一般人为耳垂，指头，通常在耳垂取血（现场取血建议用大头针采血，一人一针，避免血传疾病）。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻动耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入耳垂下端12毫米，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻向挤压出血。,血膜的制作（取血操作）,取血量及涂片法（涂片操作）,薄血膜 取洁净的载玻片2张，1张平置在桌上，以左手拇指，食指夹持载玻片两端（手指切勿接触玻片表面），用另一张边缘平滑（最好为磨口边缘）的载玻片做推片，用推片一端边缘的中点从取血部分取约1微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成2530度夹角，待血液向两侧扩展约2厘米长度时，均匀而迅速地轻轻向左推出（约2.5厘米长），整个血膜成舌形。,正确的推片姿势,取血量及涂片法（涂片操作）,厚血膜 用推 片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81厘米大小圆形厚血膜，血膜厚薄均匀，过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。,涂制厚、薄血膜的位置 通常是将厚、薄血膜涂在一张载片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人，涂2个厚血膜1个薄血膜，以防血膜脱落而影响检查。,标准的疟疾厚薄血膜片位置,血片的染色,一、吉氏染液母液配制 取吉氏粉0.5克置于研钵中，加少量甘油充分研磨，边加边磨，至25毫升加完为止，倒入60或100毫升带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量无水甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至25毫升甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中2小时，或室温内35天，每天用力摇动5分钟，即成原液。吉氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。,血片的染色,二、瑞式染液的配制将瑞氏染剂粉1g置于研钵内，加入15ml甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用500ml甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。此方法染色的时间短，但染色效果不如吉氏染液效果稳定，又不能大量血片染色，可用于门诊应急血片用。,血片的染色,吉氏染液血片染色方法 （推荐使用此方法）先用甲醇或无水酒精固定薄血膜，待干后进行染色。在固定薄血膜后用清水对厚血膜溶脱血红蛋白可用滴管滴水于厚血膜上，待血膜呈灰白色时，将水倾去，晾干后进行染色。 成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀释液（2毫升原液加中性蒸馏水98毫升稀释均匀即成），同时对厚薄血膜染色30分钟（如染液不合标准时，得酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液冲去，再用清水轻轻冲洗一次，干净后将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干镜检。,血片的染色,单张血片染色：薄血膜经固定干燥后，用2%吉氏染液稀释液12毫升，滴入血片标本上染色30分钟左右；或用中性蒸馏水1毫升，加吉氏母液12滴，混合均匀后滴入血片标本上，染色1020分钟，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，（切勿先倒掉染液再用水冲洗）晾干镜检。,瑞氏染液的染色方法：,先用蜡笔在厚、薄血膜间划一界限，滴几滴蒸馏水在厚血膜上溶血。溶血后倾去水滴。在薄血膜上加瑞氏染液58滴，染色12分钟。然后再加58滴蒸馏水于薄血膜上，用吸管将染液与蒸馏水混合均匀后，把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色10分钟。用清水轻轻冲去染液，晾干。,血片的镜检,在学习镜检疟原虫之前，必须先对正常厚薄血膜中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。学习镜检疟原虫，首先要学看薄血膜，在基本上掌握薄血膜中疟原虫形态后，才学习镜检厚血膜。镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时参考和血片编号之用。镜检疟原虫必须用油镜头配合5X低倍目镜镜检，当发现疑难问题时可调换10X目镜进行观察。检查时应从厚血膜的上缘开始，使血膜从上而下，自左至右，由右至左，一行接一行，一个视野稍叠一个视野顺序地查完整个血膜。,疟原虫血片检查结果确定,检查全部厚血膜未查见疟原虫者判为阴性。显微镜下查见疟原虫，根据疟原虫形态确定恶性疟、间日疟、三日疟、卵形疟或混合感染。,制作血膜的注意事项,1. 玻片清洗时，避免玻片碰撞、磨损。制作血膜的载玻片必须完全清洁而毫无油渍或污垢。制片时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片的玻片边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。,制作血膜的注意事项,2. 刚涂制的血膜要平放在标本盒内，厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜，干后应及时装入标本盒并盖严，新的木制标本盒需敞开放置一段时间，让木醇挥发后才能使用，以免厚血膜红蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。,制作血膜的注意事项,3. 血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能2448小时内固定染色；冬天也不能超过72小时。放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（13分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。,影响染色效果的因素,血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：（1）染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。,影响染色效果的因素,（2）染液的新旧 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制12周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。,影响染色效果的因素,（3）染液稀释后使用时间 吉氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内染色力最强。,影响染色效果的因素,（4）染液的稀释浓度 染液的浓度高其着色就快而深，从而疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不明显或消失。（5）染色时间 染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。因此染色时间应根据染液的质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。,影响染色效果的因素,（6）染色用水 染液的稀释用水和染色后冲洗用水应选择Ph7.07.2清洁水，通常使用的新鲜的蒸馏水或过滤的冷开水，以及自来水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏碱，可用缓冲蒸馏水调整。染色后发现血膜颜色偏蓝（偏碱）或偏红（偏酸）时，可用与之相反的酸、碱度水冲洗血片予以纠正。,影响染色效果的因素,（7）染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。,疟原虫形态特征和鉴别要点,在RBC内发现疟原虫是确诊疟疾和鉴别虫种的重要依据疟原虫基本构造相同-细胞膜、质、核瑞氏或姬氏染色：核染成紫红色，胞质呈兰色，疟原虫消化血红蛋白产物-疟色素呈棕黄色疟原虫在RBC内各期形态各不相同,疟原虫在RBC内的形态（三期六种形态）,滋养体期：大、小滋养体裂殖体期：成熟、未成熟裂殖体配子体期：雌、雄配子体,人体疟原虫的基本结构,疟原虫基本构造为 细胞质（胞浆）、核和疟色素。 1.细胞浆 被染成蔚蓝色或深蓝色，随着虫体发育长大，细胞浆逐渐增多。间日疟原虫发育到大滋养体阶段，胞浆呈阿米巴样活动，胞浆内有空泡。,2. 核 即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈鲜红色，呈圆形或不规则的颗粒状。核的结构致密，只有在个别发育阶段较为疏松，例如间日疟原虫雄配子体的核。有时因胞浆厚密或染色深蓝，使核呈暗红或紫红色。3. 疟色素 不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异。间日疟原虫的色素颗粒呈短棒状，黄褐色；恶性疟原虫的色素颗粒呈细砂状，黑褐色；三日疟原虫的色素呈砂粒状，深褐色；卵形疟原虫的色素与间日疟原虫相似。疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。,4. 被寄生的红细胞 被间日疟原虫寄生的红细胞胀大、颜色变淡。疟原虫发育至阿米巴样体，红细胞出现薛氏点。 被恶性疟原虫寄生的红细胞大小正常或稍微缩小，红细胞上有时见到茂氏点。 被三日疟原虫寄生的红细胞大小正常，红细胞上可见到齐氏点。 被卵形疟原虫寄生的红细胞稍胀大或不胀大，呈卵形或一端呈伞矢状，薛氏点出现较早，于环状体阶段便可查见。,疟原虫薄血膜形态鉴别,（吉氏染色）,间日疟小滋养体-环状体,较大，约占寄生红细胞的1/3，胞浆较薄，一个核，很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2个核。,间日疟滋养体-大滋养体,经810小时，虫体增大，胞质增多，伸出伪足，阿米巴样，常含空泡。出现黄褐色的疟色素，细小、杆状，散在分布。红细胞胀大，变形，颜色变淡，并出现数量较多，淡红色的小点，称薛氏小点,间日疟-裂殖体,未成熟裂殖体经40小时晚期滋养体发育成熟，虫体变圆，空泡消失，核分成2个以上。核开始分裂又称裂殖体前期色素聚集成团块,间日疟成熟裂殖体,成熟裂殖子约有1224个，通常16个，排列不规则。受染RBC 胀大、颜色苍白、虫体几乎充满红细胞疟色素集中成堆，常聚集一侧。,配子体,疟原虫经过几次红细胞内裂体增殖，部分裂殖子在红细胞内不再进行裂体增殖，而发育为雌性配子体或雄性配子体，间日疟原虫配子体呈圆形或椭圆形，疟色素均匀分布于虫体内，核1个。,间日疟原虫雌配子体,虫体较大，占满胀大的红细胞胞质致密，色深蓝核小致密，深红色，多位于虫体一侧疟色素黄褐色，均匀散在,间日疟原虫雄配子体,虫体较小，圆形，占满胀大的红细胞胞质浅蓝核大疏松，淡红色，多位于虫体的中央。疟色素黄褐色，均匀散在,恶性疟原虫-环状体,环纤细,约为RBC直径的1/6，RBC不胀大，颜色稍紫或正常核1个或2个，红细胞常含2个以上原虫虫体常位于红细胞的边缘 ，呈“鸟飞状”不带色素,恶性疟原虫大滋养体,一般不出现在外周血虫体小结实，圆形，空泡不显著，不活动疟色素集中一团，黑褐色原虫此时开始集中在内脏毛细血管,恶性疟成熟裂殖体,裂殖子826个，通常818个，排列不规则疟色素集中成一团，黑褐色虫体占红细胞体积的2/3至3/4,恶性疟原虫雌配子体,新月形，两端较尖核1个，较小，致密，深红色，常位于中央胞浆深蓝色疟色素黑褐色，紧密分布于核周围,恶性疟原虫雄配子体,腊肠形，两端钝圆胞浆浅蓝或谈红色核1个，较大，疏松，淡红色，位于中央疟色素黑褐色，小杆状，在核周围松散分布,恶性疟原虫由于在发作间歇期，绝大部分疟原虫要进入内脏毛细血管发育，周围血液内仅能发现环状体和配子体。因此，恶性疟在发作期为最适宜的查血时间。 如在血膜上查见许多这样的小滋养体而无大滋养体，可判定为恶性疟原虫。恶性疟原虫粗大环状体与间日疟原虫的环状体相似，较难区别。此时应依据血膜上有无其他发育阶段的疟原虫来确定。 如果血膜上只有少数环状体，其形态又不太典型，则应另外取血检查，不应轻易下结论。,三日疟原虫主要形态特征,1. 寄生的红细胞正常或缩小，有淡红色细小的齐氏点2.环状体中等大小，核较大，胞浆粗厚；3.滋养体胞浆常呈带状，核呈条状，疟色素深褐色，粗大常沿边缘分布；4.裂殖体小于正常红细胞，核612个，常排列成菊花状，疟色素常聚集于中央；5.雌雄配子体小于正常红细胞，色素呈深褐色；6.常可查见各阶段的疟原虫。,卵形疟原虫的主要形态特征,1. 寄生的红细胞正常或稍胀大，可呈卵圆形或边缘呈锯齿（伞矢）状，薛氏点出现较早粗大，量多； 2. 环状体中等大小，核较大，胞浆粗厚； 3. 滋养体胞浆常呈圆形，空泡不明显，疟色素棕黄色，粗大常沿边缘分布； 4. 裂殖体小于正常红细胞，核612个，